啤酒作为一种大众化的饮品,它的风味、泡沫及色泽是影响消费的三大重要因素,而又以风味最为突出[1]。目前,影响啤酒风味的一个重要因素双乙酰已经不再那么困扰啤酒生产企业,而乙醛含量过高却成为我国啤酒行业面临的重要难题。
选育优良的啤酒酵母菌[2],对提高啤酒的质量有着重要的意义。国内外关于降低啤酒发酵过程中乙醛含量的研究主要集中于工艺条件、杂菌污染等方面[3～5],而采用基因工程技术改良酵母以降低乙醛含量的研究相对较少。
本试验有针对性地破坏酵母乙醇脱氢酶Ⅱ基因,以期降低啤酒中乙醛含量。本文通过 PCR 技术获得一段带有筛选标识和同源区域的目的基因,通过醋酸锂转化法,使目的基因与酵母 ADHⅡ基因发生同源重组,得到一株 ADHⅡ基因突变的工业酿酒酵母。突变菌株通过驯养,小试发酵生产啤酒,利用气相色谱测定发酵液中乙醛及其他风味指标含量。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种及质粒
C-0011 酵母: 中国食品发酵工业研究院菌种保藏中心保藏,是一株用于酿酒的工业酵母。
pFA6a-kanM X4 质粒: 清华大学陈国强教授馈赠,是一种穿梭质粒, 在大肠杆菌中对氨苄青霉素有抗性,在酵母菌中对遗传霉素 G418有抗性。
1.1.2 培养基及试剂、仪器
1.1.2.1 培养基
HYLB 培养基:4.3% HYLB,2% (v/v) 三糖葡萄糖溶液 ,10 % (v/v)0.17 mol/L KH2PO4 和 0.72 mol/L K2HPO4 磷酸盐缓冲液,用于培养大肠杆菌。
YPD 培养基:1% 酵母提取物,2% 蛋白胨,2% 葡萄糖,用于培养酵母菌。
1.1.2.2 主要试剂及主要仪器
主 要 试 剂 :Taq,pfu 酶由上海生工提供 ,AMP, mG418,NAD 酶由鼎国生物公司提供。
主要仪器:PCR 仪,小型离心机,恒温培养箱,恒温水浴锅,气相色谱仪,分光光度计。
1.1.3 引物
引物由上海生工合成,各引物序列见表 1。
为了敲除乙醇脱氢酶Ⅱ(ADHⅡ)基因,而设计了一对引物 F718,R719, 此对引物是根据酿酒酵母 ADHⅡ基因和 pFA6a-kanM X4 质粒中 kanM X 基因而设计的,酿酒酵母ADHⅡ基因的序列可以通过http://www.yeastgenome.org/网站查询, 该引物是用来扩增转入目的基因的一对引物。F718(R719)有 41(40)个碱基与酵母染色体 ADHⅡ基因相同,用来进行同源重组。而 F718(R719) 有 18 (19) 个碱基与质粒 pFA6a-kanM X4 中kanM X 基因相同,用来扩增 kanM X 基因以筛选转化菌株。
1.2 方法
1.2.1 聚合酶链式反应[6]获得目的片段
1.2.2 醋酸锂转化法[7]转化酵母DNA
由含 G418 的抗性平板筛选突变菌株,在转化后 7～12d 长出针尖状单菌落。
1.2.3 发酵试验
1.2.3.1 菌种的驯养
将活化好的突变菌株接入到装有 300 mL 麦汁的500mL 三角瓶中,12℃厌氧发酵, 称重直至发酵结束。取 1勺菌体再重新接入 300mL 麦汁继续发酵, 连续发酵 5 次,将驯养后的菌体稀释涂布抗性平板,挑取较大菌落保存。
1.2.3.2 啤酒生产小试
将驯养后的菌株和原菌株分别接入装有 300mL 麦汁的 500mL 三角瓶中,12℃厌氧发酵, 跟踪发酵过程,测定各项指标。
1.2.4 综合指标的测定[GB/T4928-2001]
1.2.4.1 双乙酰含量的测定
1.2.4.2 发酵度的测定
1.2.4.3 风味指标的测定
利用气相色谱仪采用外标法测定,发酵液要求滤出菌体,再装入顶空瓶进行测定。
风味指标包括:乙醛、 DM S、甲酸乙酯、乙酸乙酯、甲醇、乙醇(v/v)、乙酸异丁酯、正丙醇、异丁醇、乙酸异戊酯、异戊醇、己酸乙酯、辛酸乙酯。
色谱柱与色谱条件:色谱柱(不锈钢或玻璃):2m ;
固定相:Chrornosorb 103,60-80 目;柱温:200 ℃;气化室和检测器温度:240 ℃; 载气 (高纯氮) 流量:40mL/min;氢气流量:40mL/min;空气流量:500m L/min。
2 结果与分析
2.1 突变菌株的获得
以 F718,R719 为引物, 以质粒 pFA6a-kanM X4 为模板进行 PCR 扩增,得到转化目的片段。采用一步基因转化法获得突变菌株。结果见图 1。
2.2 突变株未驯养前发酵液各项指标测定
突变株未驯养前发酵液各项指标的气相色谱测定结果见图 2。
突变株乙醛含量为 5.386mg/L,由于突变株发酵性能尚未稳定,但比原菌株乙醛含量 7.932mg/L 已有所降低。
2.3 驯养后的突变株小试发酵液各项指标的测定
2.3.1 跟踪测定发酵液中乙醛指标
连续跟踪 5d测定发酵液中乙醛含量,结果见图 3。
从图 3 可看出,针对单一风味指标乙醛,在整个发酵过程中突变株比原菌株乙醛含量相应降低,说明我们利用基因工程技术实现对啤酒酵母的改良。
2.3.2 发酵结束时各项指标测定(图 4,图 5)
从图 4, 图 5 可以看出, 除了双乙酰、甲酸乙酯、DMS 外,发酵液中其他风味指标也相应降低,而啤酒的好坏是一个综合指标的衡量,小试生产和工业化生产存在着差异,所以此株菌是否适合大众口味,能否用于工业化生产还有待于进一步鉴定。
3 结论
3.1 通过基因敲除技术获得了一株 ADHⅡ基因突变的工业酿酒酵母,通过驯化逐渐适应啤酒酿造环境。
3.2 通过连续 5d 跟踪测定乙醛指标,显示突变株乙醛含量与原菌株比较相应降低。
3.3 驯养后的突变株发酵结束时,双乙酰含量为 0.058mg/L与原菌株0.034mg/L 相比有所升高。突变株发酵度为63% ,比原菌株 66% 略有降低。突变菌株其他风味指标也相应降低,这是否影响到啤酒的综合指标及口感还有待于专家鉴定。
参考文献:
[1] 廖惟,顾国贤,等.啤酒风味老化-老化机理及抗老化的研究进展[J].酿酒,1996,112(1):1-15.
[2] 单连菊、张双玲.浅谈啤酒酵母的研究与发展[J].酿酒,1999,(4):56-57.
[3] 杨 毅,冯景章.啤酒酿造过程中影响乙醛变化因素的研究[J].食品与发酵工业,2002,28(10):25-30.
[4] GeigerE andPiendlA.Technologicalfactorsintheformation ofacetaldehydeduringfermentation[J].M BAA Technical Quarterly,1976,13(1):51-63.
[5] 李宏.啤酒中乙醛的研究[D].北京:中国食品发酵工业研究院,2004.
[6] 奥斯伯 F,布伦特 R,等.颜子颖,王海林译.精编分子生物学实验指南 (第三版)[M ].北京:科学出版社,2001.
[7] 萨姆布鲁克 J, 拉塞尔 D W .黄培堂,等译.分子克隆实验指南(第三版)[M ].北京:科学出版社,2002.
