西藏乳制品历史以来，一直以传统方式生产。牦牛平均每一泌乳期的产奶量为600公斤（幅度为120-1000公斤以上），含脂6.5-7%（金黄色和大脂肪球），5.3%蛋白质，4.6%乳糖和17.4%的总干物质，营养价值高。通过添加乳酸菌发酵制成的发酵乳制品，可提高西藏酸乳制品的营养价值，开发风味独特及医疗保健作用的营养保健食品。目前酸乳制品大多由保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌两种菌混合发酵制成，两菌之间的比例和数量对其风味影响较大，而乳酸菌不仅生长要求高、菌落细小，且两菌菌落形态相似。市场售价较高，在西藏乳制品生产中应用较少，本试验即通过对优良乳酸菌的扩大培养，并对其性能加以测试，以满足西藏乳制品的生产要求。
1. 材料与方法
1.1 菌种来源
产品名：发酵酸奶直投式菌种
保质期：原封包装 -18℃冷冻12个月，-5℃冷冻6个月、15g/包
生产日期：2003年7月7日。
生产基地：鹰潭市胜利路112号，上海健鹰食品科技研究所经销。
产品说明：本品是采用由荷兰、澳大利亚等地进口的冷冻干燥保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌复合处理而成。
1.2 仪器设备和主要试剂
1.2.1试剂：胰蛋白脉、酵母膏、乳糖、乙醇、革兰氏染液、乳粉、琼脂、牦牛乳(自制)。
1.2.2主要设备：超净工作台、高压灭菌锅、生化培养箱(SPX-150)、厌氧装置、数码生物显微镜（SN-200M）。生物发酵罐（GUJS-10-B-I）、冷冻干燥机（LGJ10）
1.2.3分离配养基由胰蛋白酶、酵母膏、乳糖、琼脂、钙钾盐等配置而成。
1.3 菌种扩大培养
1.3.1培养基的选择和培养
采用改良西红柿汁培养基：酵母膏0. 75g,蛋白胨0. 75g,葡萄糖1g,KH2P04 0.2g，西红柿汁10ml，自制土豆淀粉0.3g，油酸 25ug/ml，亚油酸 25ug/ml，吐温80 0. 05ml,蒸馏水90ml，pH7. 0。按以上比例制成1000ml培养液，121℃灭菌20min。
接种保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌制成品1g，于35℃培养24h。
1.3.2乳酸菌的收获与浓缩
乳酸菌的收获用离心分离法。在4000×g的加速度下离心20分钟，弃上清液。离心分离法可将培养液中的乳酸菌细胞浓缩20倍，但离心过程对细胞的损伤也较大。
1.3.3固体乳酸菌种的制备
将收集的乳酸菌细胞液按等体积比例悬浮于自制的脱脂乳介质（它包含3%的明胶，5%柠檬酸钠，2%谷氨酸钠，10%蔗糖 78%脱脂牦牛乳，用1 mol/L氢氧化钠调节细胞悬浮液的pH呈中性）中，制成浓缩乳酸菌悬浮液，这种介质对乳酸菌的冷冻干燥具有很好的保护作用。并分装于无菌烧杯中，在冰-丙酮浴中冷冻，放人冷冻干燥机内进行冷冻干燥(绝压4帕，-47℃)持续20-25小时，当冷冻干燥物水分含量达到2%时，进行无菌分装，在低温冰箱中贮藏。成品浓缩干燥乳酸菌发酵剂含活菌数为1.2×1010CFU/g。
1.4 菌苗检验
1.4.1培养基：蕃茄琼脂固体培养基
1.4.2菌落中细菌的染色鉴定
将保存的菌株置室温条件下解冻。然后用接种环蘸取适量的稀释液，接种于不同的琼脂平板培养基或肉浸液肉汤增菌液中37℃培养18-24h，检查菌落形态，数码显微镜下观察其特性，并进行革兰氏染色，观察其形态。革氏染色镜检，结果为革兰氏阳性，链球状菌；从分离培养基上挑取白色菌落，涂片，革氏染色镜检，结果为革兰氏阳性，细杆状菌，两端钝圆，有的单个，有的成链。
1.4.3两种菌株含量检验：在不同的培养酸度过程中，通过红血球计数板统计保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌在单位体积内的数量变化比值（如表1）。
由表1可知，在培养试验中1.4.3两种菌株含量检验：在不同的培养酸度过程中，通过红血球计数板统计保加利亚乳酸杆菌和嗜热链球菌在单位体积内的数量变化比值（如表1）。
，随着培养液酸度的升高，嗜热链球菌的活性降低较快，而保加利亚乳酸杆菌活性降低较慢。
2 发酵试验
经固体培养基分离和液体培养基扩大培养的嗜热链球菌接种于脱脂乳中，在不同温度下培养发酵，结果嗜热链球菌在40℃左右时约需3h凝乳;在45℃以上，随着温度提高，凝乳时间延长；当培养温度大于55℃时，没有凝乳发生。当培养温度低于40℃时，随着培养温度的降低，凝乳时间延长；当温底低于25℃时，不能凝乳。
将分离和扩大培养的保加利亚杆菌接种到脱脂乳中，在不同温度下培养发酵，结果保加利亚杆菌在40℃范围内约4h凝乳，当培养温度大于45℃时，随着温度的提高，凝乳时间延长，而温度超过55℃时，发现不能凝乳现象；当培养温度低于40℃时，随着培养温度的降低，凝乳时间延长，而温度低于25℃时，不能凝乳（如表2所示）。
将上述鉴定过的细菌分别接种到乳中培养，凝乳后染色鉴定。40℃乳中培养时，嗜热链球菌生长旺盛，镜下可见大量嗜热链球菌成短链交织在一起；放置冰箱一定时间，酸乳的酸度增加，镜下可见嗜热链球菌的链变成长链，但存放时间过长，则链变短，甚至出现双球菌或成单个球菌形态。而保利亚杆菌在40℃培养时，形成单杆菌或双杆菌；放置冰箱中有时杆菌首尾相连形成长链状，但其中间有间隔，有时甚至出现异常变化，杆菌变为球状或不规则状。因此，嗜热链球菌和保加利亚杆菌在冰箱保存时不宜放置过长时间。
3结论
通过以上试验，可用较简便的培养基（改良西红柿汁培养基）进行培养，有效地进行两种优良乳酸菌的扩大培养。通过离心，加入脱脂牦牛乳介质中，经冷冻干燥机干燥，可获得较为优良的、易保存的菌种。经固体培养基培养和计算，浓缩干燥乳酸菌发酵剂含活菌数为1.2×1010CFU/g，单位发酵剂中菌种含量较高。此产品可为西藏自主开发酵乳制品，培养优良乳酸菌品种创造条件。
经用提过酥油的牦牛乳进行发酵培养，在40℃可获得风味和口感优良的酸乳。西藏每年有大量提过酥油的乳品，加工和食用酸乳也是西藏民族饮食习惯的一部分，但一般都采用自然发酵，杂菌和卫生条件远远达不到国家要求，口味较差，产品较难在市场销售。因此，有必要在菌种的选择、发酵温度控制方面进行探索和改进。
