作者：西华大学生物工程学院 方升平 王维香** 发布时间：2009-1-6 11:05:00
多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids PUFAs）是指含有2个或2个以上双键且碳链长18～22个碳原子的直链脂肪酸[1]。功能性PUFAs根据结构分为两大类：一类是ω-3PUFAs，在多不饱和脂肪酸分子中，距羧基最远端的双键在倒数第3个碳原子上的称为ω-3PUFAs，主要包括α-亚麻酸(ALA)、二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)；另一类是ω-6PUFAs，在第6个碳原子上，则称为ω-6PUFAs，主要包括亚油酸(LA)、7-亚麻酸(7-LJNA)和花生四烯酸(AA)。
ω-6 PUFAs的重要性，早在20世纪50年代就开始研究，而ω-3PUFAs的生理调节功能和保健作用，是在近20年才被人们逐渐认识并做了大量的研究工作。药理实验证明[2]，α-亚麻酸、EPA和DHA等ω-3PUFAs都具有降血脂、降血压、促进脂肪代谢、于治疗和防治心血管系统疾病。目前，许多国家都在开发以α-亚麻酸、EPA和DHA为主要成分的保健食品和医疗药品。但ω-3PUFAs的来源较少，主要来自海洋哺乳动物及鱼类的油脂，如鲱鱼油中EPA和DHA分别占总脂肪酸的16.03％和10.83%[3]。陆地动物和植物油中含ω-3PUFAs甚微，仅发现亚麻油（15.60％）[3]、紫苏油（56.14％-64.82％）[4]和蚕蛹油（31.63％）[5]等少数植物和动物油含有较高的ALA。目前已有许多ω-3PUFAs产品上市，大都来自海鱼的油脂，来源有限，必须开发新资源，从陆地动植物和微生物油脂中寻找和开发含ω-3PUFAs的原料，使用生产效率更高的生产方法。 本文就目前ω-3PUFAs的生产研究进展进行阐述。
1 从生物体中直接提取ω-3PUFAs
1.1 有机溶剂提取
传统的生产方法包括热加工法、机械压榨法、溶剂浸出法等。热加工法、机械压榨法最大的优点是投资少、操作简便，但出油率低、成品油中活性物质含量低。而溶剂浸出法条件温和、成品油质量高，所以此种方法的应用日益广泛。常用的提取溶剂有氯仿～甲醇、乙醚～石油醚、乙醇等。姚领等[7]采用氯仿～甲醇提取法和乙醚～石油醚提取法分别提取三角褐指藻中的不饱和脂肪酸，通过气相色谱技术分析EPA和DHA的含量，含量分别为12%-18%和2%-3%。张秀妍等[7]用乙酸乙酯从玻璃海鞘中提取多不饱和脂肪酸，在最佳提取条件下，利用气相色谱进行分析，测得多不饱和脂肪酸含量为66.40％，EPA和DHA含量之和为15.20％。王海英 [8]等用正十九酸内标液和CHC13～CH3OH混合液从牟氏角毛藻、三角褐指藻、硅藻舟形藻中提取多不饱和脂肪酸，研究其组成，3种藻中的多不饱和脂肪酸主要为EPA，含量分别为7.6％、11.7％和7.1％；DHA含量都相当低，分别为0.3％、0.46％和1.1％。现在有机溶剂提取法的焦点在于提高提取率，寻找专一性强的有机溶剂，使溶剂浸出法由实验室走向工业化生产。
1.2 酶解法提取
酶解法的优点在于作用条件温和，生产的鱼油质量高，同时可以充分利用蛋白酶水解产生的酶解液。刘书成等[9]利用蛋白酶酶解法从黄鳍金枪鱼加工的下脚料—鱼头中提取鱼油。在最佳酶解工艺参数下，粗鱼油的提取率为4.22％ ，理化指标达到了SC/IB502-2000的粗鱼油二级标准，多不饱和脂肪酸总含量高达38.47％ ，其中DHA和EPA的含量分别为23.63％和4.84％。吉宏武[10]等用酶解法从罗非鱼下脚料中提取多不饱和脂肪酸，经过离心、脱胶、脱酸、脱色、脱臭和脱腥处理后，不饱和脂肪酸占57.58％，其中多不饱和脂肪酸占19.37％，不饱和脂肪酸18：3(ω-3)(亚麻酸)，为3.04％。
近年来Fujita[4]提出了一种简单浓缩ω-3PUFAs的方法，结合酶水解与低温结晶法，用以高度富集多不饱和甘油三酯。酯酶作用甘油三酯具有专一性，含有EPA和DHA的甘油三酯被酯酶水解的速度比不含有EPA和DHA的甘油三酯慢的多。饱和甘油三酯在丙酮中的溶解性随着链长度增加而明显减少，但随着不饱和度的提高，其在丙酮中的溶解性也提高。因此，多不饱和甘油三酯在-60℃下容易溶解在丙酮中，而饱和脂肪酸或含有饱和脂肪酸与单烯酸的甘油三酯在-60℃低温下经固定化就可被除去。这样，提高了鱼油中的EPA和DHA的含量。
1.3 超临界CO2提取法
超临界CO2萃取是近年来发展起来的新型的化工分离技术。由于它的萃取温度低(CO2的临界温度为31.1℃)、不易破坏被萃取物的生理活性、选择性好、无溶剂残留，所以特别适合于萃取鱼油这类热敏性、易氧化的天然产物。
姜爱莉等[11]用超临界CO2从柄海鞘(Styela clava)干粉中提取多不饱和脂肪酸，正交实验对提取工艺条件进行研究，利用气相色谱进行分析，其多不饱和脂肪酸含量为75.77%，EPA和DHA含量之和为19.47％。黄俊辉等[12]以海带为原料，采用超临界CO2萃取法进行海藻多不饱和脂肪酸提取的研究，可使海带总脂肪酸中多不饱和脂肪酸含量达到67.2％。南京大学卢晓等[13]用程序升压法进行了超临界CO2萃取鱼油的实验，得到了纯度为89.2％的EPA甲酯，并认为精馏柱的温度梯度以40～80℃为宜，因为温度梯度增大，溶剂比S/F随之增加，CO2循环量增加，而且顶端温度升高，容易使精制鱼油发生化学变化。刘伟民[14]在内径为l4mm，高为l800mm的精馏柱里进行了鱼油连续式萃取的实验，他利用四段温度梯度产生内回流，CO2和鱼油都从柱子底部以上0.2m处进人，轻组分从顶部出来，重组分从底部出来，在最佳工艺参数下操作，得到底部EPA和DHA总含量为85.3％的产品。
2 微生物发酵生产
很早以前，人们就知道微生物细胞中含有PUFAs。微生物具有生长周期短、培养简单和不受原料限制等特点，所以研究人员转而寻求和利用微生物生产PUFAs。微生物脂肪酸构成的质量和数量受培养基组分、通气、光照强度、温度和培养时间等环境因素的影响。使用微生物大量生产多PUFAs，比从海水鱼中提取具有明显的优点。使用基因工程选育菌种，有可能大大增加藻类和真菌产生EPA，DHA和其他多不饱和脂肪酸的潜力。藻油中的EPA比鱼油显示有更大的氧化稳定性，没有鱼油的气味和滋味[4]。
2.1生产工艺流程
微生物油脂的生产工艺流程如下[15]：菌种筛选与构建→原料→灭菌→菌体培养→菌体收集→预处理→油脂提取→精炼→成品油脂。发酵得到的油脂其主要组成为甘油三酯和游离脂肪酸，同时还有一些非极性物质；另外还有部分未鉴别出来的微量成分。但是这些油脂还不能直接食用，因为微生物油脂具有一定的毒性，必须经过后期处理，方可供食用。
2.2 菌种筛选与选育
目前在PUFAs的生产中具有开发潜力的主要有藻类和霉菌。在各种藻类中，金藻纲、黄藻纲、硅藻纲、绿藻纲、隐藻纲的藻类都能产生高产量的EPA，其中Rhodonhuceae中的EPA含量高达50％左右[16]。甲藻纲中的藻类具有高含量的DHA。真菌中高山被孢霉、长被孢霉、水霉、轮枝霉、樟疫霉、毛霉、小克银汉霉等含有EPA、ARA， 被孢霉、卷枝毛霉、鲁氏毛霉等菌中含有了α-亚麻酸。长被孢霉、畸雌腐霉、破囊壶菌、终极腐霉、头孢霉等[17]均含有EPA、DHA，所有这些高产EPA和DHA微生物的发现为EPA、DHA的大量生产提供了优质的工业菌种。
高产菌株的筛选可以采用物理和化学诱变法及利用基因工程和原生质融合技术进行菌种改造等以获得高产工程菌株。黄建忠[18]等人以深黄被孢霉AS3.3410为出发菌株，经紫外线、硫酸二乙酸和亚硝基胍等复合诱变选育得到M018突变株，其60L 罐发酵生物量达到37.8g/L，油脂含量为79.2％，油酸、亚麻酸、GLA总量为68.4％。刘吉华等[19]利用轮枝霉发酵生产EPA、AA，在初步优化培养条件下，EPA、AA分别达到253.7mg/L和549.8mg/L。
通过对微生物合成PUFAs途径的研究，还选育出了某些特定位置的脱饱和酶缺陷菌株来发酵生产高含量的PUFAs。为提高高山被孢霉中EPA的含量，Jareonkitmongkol等[20]筛选出一株△-12脱饱和酶的缺陷菌株，培养10天后，其EPA的含量达到1.0g/L，生物量达到6.4 g/L。
2.3 大规模培养菌株
M.Gfima和他的同事们[21]报告了用恒化器中进行培养金鞭藻，大规模生产EPA和DHA。他们认为：适于细胞大量生长的条件和高含量脂质的生产条件是相反的，生长速率最高的生长条件并不是EPA和DHA能达到最高含量的生产条件。因此，必须进行动力学研究，以便对发酵过程进行代谢调节，提高PUFAs的发酵产量。
美国Martek公司[4]筛选异养微藻得到微藻MK8805，在优化条件下油脂为细胞干重的10％，其中DHA占总脂肪酸的30％。将MK8805在350L发酵罐中培养48h后，细胞产量为25g/L。虽然其含油量稍低，但由于油脂中仅含DHA一种多不饱和脂肪酸而易于提取，分馏后DHA浓度达80％。
2.4 浓缩提取方法
大多数鱼油中EPA和DHA的提取方法也可用于微生物中EPA和DHA的纯化和提取。这些方法有：溶剂提取法、尿素包含法、真空蒸馏法、分馏法、液相色谱法和超临界CO2提取法等。一般是将几种方法结合起来使用。最普遍的方法是在加工中用冬化处理来冷却脂质，最后产物中的EPA浓度可达到总脂肪酸的23％-35％[22]。目前EPA的提取多采用有机溶剂法、水提取法，但二者均有弱点。有机溶剂法提取产量虽高，但溶剂残留量大，不宜食用且易燃易爆成本昂贵；水提取法则提取产率较低；而采用CO2超临界萃取法提取真菌中的EPA是一种较好的提取EPA的方法。
尿素包合法能有效地富集鱼油中的ω-3PUFAs，尿素含量与产品的总产率成正比。经过多次尿素包合分离或多些尿素一次分离，液体部分中多不饱和脂肪酸的含量也可达到70％-80％[17]以上。尿素包合法操作条件温和，多不饱和脂肪酸不易被破坏，但是需要大量尿素，成本高，得率受影响。将尿素包合法和超临界气体萃取法结合运用，则有可能使EPA和DHA总量在80％以上，并可将其分离[24] 。
分子蒸馏是在相当于绝对大气压1.33×10-3～1.33×10-5 kPa高真空下可以去除其相互间的引力，因而分子的挥发性极其自由，理论沸点几乎不存在，这样，虽然处于低温条件下，但被分离的组分的挥发性仍显著地增加，不仅降低了它的沸点，减少了热变性，而且还可以提高EPA和DHA的分离效果[24] 。
高效液相色谱法是通过逆相分配法进行分离。根据EPA和DHA以及其它脂肪酸在流动相和固定相中的分配系数不同。目前日本已可以用大型的制备柱来进行生产制备高纯EPA和DHA。
根据EPA能够以脂质混合物或脂肪酯的形式从菌体中提取，Fajita和Makuta发明一种工业化提取EPA及其酯的专利，该专利提取的EPA可占总脂肪酸中EPA的93％，生产过程主要包括尿素包含和分馏 [21] 。
2.5 研究展望
利用微生物发酵法生产PUFAs是继动物和植物来源后的又一个新兴的开发途径，其优势十分明显，针对目前的研究现状与存在问题，对发酵法生产PUFAs的研究目标建议如下：(1)充分利用现代生物技术选育构建高产稳定的菌种；(2)研究PUFAs的代谢调控方法和最佳培养条件优化；(3)开展发酵动力学研究与优化控制； (4)建立简单高效的PUFA提取纯化系统；(5)寻找可以利用的廉价底物。
3 转基因法生产多不饱和脂肪酸
适当地改变传统产油生物体的基因，使某些功能性油成分增加。改变油脂组分最大的挑战是改变脂肪酸的不饱和度及缩短或加长脂肪酸链。这就涉及脂肪酸组成的3种相互依存的基因技术：①PUFA生物合成中编码蛋白的基因克隆；②编码蛋白基因的转基因表达；③克隆基因的修饰以产生表达蛋白。该领域的研究已取得了一定进展，已经表征和克隆了与脂肪酸不饱和度有关的可溶性酶和膜结合酶。另外，从一个物种到其它种的脱饱和酶基因的同源转移，也为发展需要的产PUFAs菌株提供了潜力。因此，研究不同来源的脱饱和酶基因的功能性变化，对获得特殊PUFAs产品是非常重要的。
随着科学技术的进步，ω-3PUFAs研究正方兴未艾，尤其是根据生物合成的特点结合现代生物技术，立足于传统的生产方法的基础上，ω-3PUFAs的生产将会出现新的突破。
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