国内应用于酸奶生产的直投式发酵剂（Direct Vat Set, DVS）用量巨大，但全部依赖于进口[1 ]。随着我国发酵乳制品工业的迅猛发展，已对乳酸菌的分离鉴定、增殖培养、冻干保存等直投式酸奶发酵剂制备技术的关键问题进行了一定的研究与探讨[2]。积极筛选优良菌种、建立直投式酸奶发酵剂制备技术，大力开发具有我国自主知识产权的优质直投式酸奶发酵剂势在必行。
本实验对直投式酸奶发酵剂的发酵工艺中的关键技术进行研究，利用5L发酵罐进行发酵工艺研究，确定从EZAL-MY96直投式酸奶发酵剂中分离得到的３株乳酸菌中每一菌株的最佳发酵工艺参数。冷冻干燥后的３株乳酸菌按照一定的比例混合制备出优质的DVS。本研究结果为直投式酸奶发酵剂的工业化生产提供了重要的理论和实验数据。
1．材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料
本实验室保藏的乳酸菌单菌株（嗜热链球菌1株，以下简称球菌；保加利亚乳酸杆菌2株，以下简称杆菌1和杆菌2）[ 2]。麦芽汁（青岛啤酒集团）；番茄汁（本实验室自制）；脱脂粉（内蒙古呼伦贝尔农垦雪花乳业）。
1.1.2培养基
PY培养基；M17球菌半选择培养基；MRS杆菌半选择培养基；复壮培养基（乳球菌和乳杆菌分别采用液体M17培养基和液体MRS培养基）见文献[3]；球菌工业化液体超浓缩培养基；杆菌1工业化液体超浓缩培养基；杆菌2工业化液体超浓缩培养基见文献[4]。
1.1.3仪器设备
BIOF-2005型发酵罐，FD-1B-55型冷冻干燥机，高压灭菌器，超净工作台，恒温培养箱，恒温震荡器。
1.2方法
1.2.1 DVS菌株种子液的获得
本实验对目前广泛使用的法国罗地亚公司EZAL-MY96发酵剂应用形态学观察及糖发酵实验进行菌株的分离鉴定，分离和筛选出３株具有优良特性的菌株，分别为1株球菌和2株杆菌（分别命名为杆菌1和杆菌2），利用这３株乳酸菌进行直投式酸奶发酵剂的制备。将球菌菌种利用PY增殖培养基在42℃的条件下培养8h制备出球菌种子液，将杆菌1菌种利用MRS培养基在37℃的条件下培养23h制备出杆菌1种子液，将杆菌2菌种利用MRS培养基在37℃的条件下培养22h制备出杆菌2种子液。
1.2.2 DVS菌株的发酵工艺
３株乳酸菌各自在5L发酵罐中进行发酵工艺试验。球菌发酵实验采用的工艺流程为：将球菌种子液按照2%～3%的接菌量接到已灭菌球菌工业化液体超浓缩培养基中，调节初始pH为7.0后，在42℃的条件下发酵，发酵罐的搅拌转速为100r/min～120 r/min；杆菌1的发酵实验采用的工艺流程为：将杆菌1的种子液按照2%～3%的接菌量接到已灭菌的杆菌1工业化液体超浓缩培养基中，调节初始pH为6.2～6.4后，在37℃的条件下发酵，发酵罐的搅拌转速为100～120r/min；杆菌2的发酵实验采用的工艺流程为：将杆菌2的种子液按照2%～3%的接菌量接到已灭菌的杆菌2工业化液体超浓缩培养基中，调节初始pH为6.2～6.4后，在37℃的条件下发酵，发酵罐的搅拌转速为100～120r/min。
1.2.2.1 DVS菌株生长曲线的确定 利用上述发酵工艺流程，进行3株乳酸菌菌株得生长曲线测定。球菌每1 h 取样、杆菌1和杆菌2均每2 h取样进行活菌数的测定，绘制生长曲线。 1.2.2.2 DVS菌株的冻干
将3株乳酸菌发酵后的发酵液在各自的生长曲线的最高值时取出，采用冷冻离心机在4℃20min，转速为6000r/min。离心后分别加入各自湿菌体量2倍质量的3株乳酸菌特异性冻干保护剂，其中冻干保护剂配方见文献[ 4]。冷冻干燥采用程序为-40℃冻干20h，冻干后利用-80℃的低温冰箱保存。
1.2.2.3 DVS菌株的生化特性分析 测定DVS菌株在5L发酵罐培养过程中培养液总蛋白含量、甘油三酯含量变化情况，测定培养液中乳酸含量变化情况，具体步骤均按说明书进行操作。实验结果均测定3个平行，然后求平均值。
1.2.2.4 DVS菌株搅拌转速的确定
根据确定的最佳工艺参数及生长曲线，来确定３株菌的发酵过程中最佳搅拌速度。球菌生长的实验基本条件为：在5L发酵罐装入3.5L增殖培养基，按3%接种量接种，在不同转速下，42℃恒温培养6h终止，分别测定活菌数。杆菌1生长的实验基本条件为：在5L发酵罐装入3.5L增殖培养基，按3%接种量接种，在不同转速下，37℃恒温培养8h终止，分别测定活菌数。杆菌2生长的实验基本条件为：在5L发酵罐装入3.5L增殖培养基，按3%接种量接种，在不同转速下，37℃恒温培养14h终止，分别测定活菌数。
2． 结果与讨论
2.1生长曲线的确定
根据３株菌在5L发酵罐中各自活菌计数，绘制出各自的生长曲线。结果如图1、图2。
图1 球菌生长曲线 图2杆菌的生长曲线
由图1球菌的生长曲线可知，到6h 左右活菌数达到最大值，因此发酵培养6h为球菌的最佳收获期，此时的发酵液活菌数为1.52 ×1010cfu/mL；由图2杆菌1、杆菌2的生长曲线可知, 杆菌1到8h 左右活菌数达到最大值，因此选择发酵培养8h为其最佳收获期，此时的发酵液活菌数为1.83× 109cfu/mL；杆菌2到14h 左右活菌数达到最大值，因此选择发酵培养14h为其最佳收获期，此时的发酵液活菌数为1.72×109cfu/mL。
2.2 DVS菌株的冻干效果
球菌冻干后所得冻干粉的活菌数为7.12×1011cfu/g，活菌率71%；杆菌1冻干后所得冻干粉活菌数为2.10×1011cfu/g，活菌率81%；杆菌2冻干后所得冻干粉活菌数为2.45×1011cfu/g，活菌率83%。由此可见，所获得产品的活菌数均超过1011cfu/g，活菌率均超过70%，达到国外同类产品的标准。
2.3 DVS菌株发酵培养的生化特性
2.3.1球菌、杆菌1和杆菌2的代谢产物乳酸含量的变化
有研究表明：球菌、杆菌1和杆菌2合成的乳酸是影响发酵液pH值的主要物质。这与赵鑫和Shakeel UR等人的研究相一致[5～7]。球菌、杆菌1和杆菌2的代谢产物乳酸的含量变化见图3、图4。由图3可以看出：球菌在12h培养液中乳酸含量最高。由图4可以看出：杆菌1在10h培养液中乳酸含量最高，杆菌2在16h培养液中乳酸含量最高，因此，3株菌合成乳酸的最大值时间均为对数生长期顶点后2到3h。球菌、杆菌1和杆菌2在菌数达到最高值时，菌体还继续合成乳酸，2到3h后乳酸含量达到最高值，此后乳酸抑制了菌体的增长。由图3、图4可知，球菌合成的乳酸量远远高于杆菌1和杆菌2，由此可知，球菌是合成乳酸的重要来源。
图3 球菌乳酸含量变化 图4 杆菌乳酸含量变化
2.2.2球菌、杆菌1和杆菌2甘油三酯的含量变化
球菌、杆菌1和杆菌2培养液甘油三酯的含量变化见图5。由图5可以看出，随着培养时间的延长，3株菌培养液中甘油三酯的积累呈越来越多的趋势，可能与菌体合成甘油三酯增多或菌体裂解释放甘油三酯有关。
图5 三株乳酸菌甘油三酯含量变化
2.2.3球菌、杆菌1和杆菌2总蛋白含量的变化
球菌、杆菌1和杆菌2培养液中总蛋白的含量变化见图6。由图6可以看出，随着培养时间的延长，3株菌培养液中的总蛋白呈升高的趋势，这可能与菌体释放蛋白质增多以及菌体裂解释放产生蛋白质多于原培养液中蛋白质含量有关，或者是培养液中蛋白质被降解产生更多数量的小分子多肽，导致试剂盒检测结果显示更高数值的关系。
图6 三株菌培养液中总蛋白含量变化
2.3搅拌转速的测定
发酵罐中培养的3株菌搅拌转速与对数生长期顶点时的活菌数之间的关系见图7、图8。
图7 搅拌转数对球菌活菌数的影响 图8 搅拌转数对杆菌的活菌数的影响
由图7、图8可以看出，球菌最佳搅拌度为100r/min；杆菌1的最佳搅拌度为100～110r/min；杆菌2的最佳搅拌度为110～120r/min。
由以上数据，确定3株菌的发酵工艺。将球菌菌种利用PY增殖培养基培养8h制备种子液，将球菌的种子液按照3%的接菌量接到已灭菌球菌廉价优化培养基中，调节初始pH为7.0后，发酵罐的搅拌转速为100r/min，在42℃发酵6h后取出；将杆菌1菌种利用MRS培养基培养23h制备种子液，将杆菌1的种子液按照3%的接菌量接到已灭菌的杆菌1廉价优化培养基中，调节初始pH为6.2～6.4后，发酵罐的搅拌转速为100～110r/min，在37℃发酵8h后取出；将杆菌2菌种利用MRS培养基培养23h制备种子液，将杆菌2的种子液按照3%的接菌量接到已灭菌的杆菌2廉价优化培养基中，调节初始pH为6.2～6.4后，发酵罐的搅拌转速为110～120r/min，在37℃发酵14h后取出。将上述3株乳酸菌取出后，均采用冷冻离心机进行离心，转速为6000r/min, 4℃，离心20min。离心后分别加入3株乳酸菌湿菌体量2倍质量的各自的菌株特异性冻干保护剂进行冻干。冷冻干燥采用程序为－40℃冻干20h，冻干后利用－80℃的低温冰箱保存。
3．结论
本实验获得来自EZAI-MY96中的３株乳酸菌各菌株的发酵制备工艺流程及最佳发酵工艺参数，为直投式酸奶发酵剂的工业化生产提供理论依据。３株乳酸菌的活菌数均在1011cfu/g，活菌率均超过70%，达到国外同类产品（EZAI-MY96）的标准。
