摘 要：对嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合培养制作保健型发酵乳进行了研究，通过正交试验优化出了最佳生产工艺：加糖量为8%，嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌比例为1∶4，接种量为4%，发酵温度为40℃。该发酵乳在4℃下贮存11天活菌数高于107cfu/ml，仍可具有良好的食疗保健作用。
关键词：发酵乳；嗜酸乳杆菌；嗜热链球菌；最佳工艺
嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）是人体肠道菌群中的重要微生物，与人体健康息息相关。当它达到一定数量时，能改善并调节肠道微生态平衡，增强机体的免疫力，降低胆固醇水平，并能缓解乳糖不耐症，抑制肿瘤细胞的形成［2］。
当前市场上已出现嗜酸乳杆菌与嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌等多菌种混合发酵的乳制品，但菌种之间的配合性影响产品中的活菌存活率，特别是保加利亚乳杆菌的代谢产物过氧化氢等可影响嗜酸乳杆菌的生长［3］，而嗜热链球菌能促进嗜酸乳杆菌的生长和存活，具有良好的共生关系。据文献报道［4］，在食品中嗜酸乳杆菌活菌数不少于106cfu/ml才能充分发挥其保健食疗作用。为了最大限度地利用嗜酸乳杆菌的保健作用，根据杆菌和球菌的共生关系，本研究用嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵，旨在寻求最佳生产工艺，开发一种具有益生功能的保健型发酵乳，以满足消费者需要。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
嗜酸乳杆菌：山东农业大学食品学院动物性食品研究室保藏。嗜热链球菌（Streptococcus thermophils）:山东农业大学食品学院动物性食品研究室保藏。
1.1.2 培养基
NFM培养基：质量分数为11%的脱脂乳培养基，自然pH值，115℃，15min灭菌，用于菌种活化。M17培养基：植质蛋白胨5.0g，聚蛋白胨5.0g，牛肉浸膏2.5g，琼脂15g，β-甘油磷酸二钠19g，酵母提取物5.0g，抗坏血酸0.5g，1.0mol/L，MgSO4·7H2O
1.0ml，蒸馏水1L，pH7.1，121℃灭菌15min，用于嗜热链球菌计数。
MRS-山梨醇琼脂培养基［5］：用山梨醇代替MRS中的葡萄糖，其他成分相同。配置时将所需成分（除山梨醇）准确称量溶解在800ml蒸馏水中，调pH至6.0～6.4，121℃灭菌15min，冷却至70℃左右，用微孔过滤装置加入200ml10%的山梨醇溶液摇匀待用，用于嗜酸乳杆菌计数。
1.1.3 原料乳
由泰安市岱岳区牧场提供。
1.1.4 主要仪器
高压灭菌锅，电热恒温培养箱，超净工作台，水浴锅，电子天平，显微镜，pH计，物性流变仪。
1.2 实验方法
1.2.1 发酵乳制作工艺
原料乳→加糖→过滤→杀菌→冷却→接种→发酵→冷却→成熟→贮存
1.2.2 酸度测定
用浓度为0.1mol/L的标准NaOH溶液滴定，以滴定酸度（0T）表示。
1.2.3 pH值的测定
采用MP-120型pH计测定。
1.2.4 黏度的测定
采用DV-Ⅲ+型物性流变仪测定。
1.2.5 活菌计数
采用倾注平板计数法。
1.2.6 感官评定方法
由工作经验丰富的专业人员10人组成感官评定小组，分别从口感、滋味和气味以及组织状态3个方面对发酵乳样品进行评定。采用百分制评分方法［6］。
评定方法：取适量试样于50ml烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态，再闻气味，然后用温开水漱口，品尝样品的滋味。
1.2.7 实验设计方法
采用L9（34）正交实验，以感官评价为指标，通过极差分析，优化出最佳发酵条件和生产工艺。并在此工艺条件下测定该发酵乳在贮存期间（4℃）的酸度、pH值及活菌数的变化。
2 结果与分析
2.1 嗜酸乳杆菌发酵特性的测定
将嗜酸乳杆菌接种于150ml灭菌脱脂乳中，37℃恒温培养，每隔2h测一次酸度和活菌数，重复8次，其结果如图1和图2所示。
由图1可以看出在培养时间内，嗜酸乳杆菌的产酸能力很强，发酸乳的酸度随培养时间不断上升，特别是6h后酸度上升极显著（P＜0.01），8h达到79.30T。
图2说明嗜酸乳杆菌的迟滞期较短，6h以后嗜酸乳杆菌经历了较短的加速期活菌数不断上升，8h以后迅速上升至109cfu/ml以上。
2.2 最佳发酵条件的确定
对正交试验结果进行极差分析表明，在酸奶制作过程中，以上4个因子的影响效果次序为：RA＞RB＞RC＞RD，表明以上A、B、C、D4因素中发酵温度对发酵乳质量的影响最大，其次为加糖量、接种量、菌种比例，如表1所示。
2.2.1 发酵温度
菌种的活性受温度的影响很大，对发酸乳的风味和滋味有重要的影响，虽然嗜酸乳杆菌与嗜热链球菌的最适生长温度分别为37℃和43℃，但两菌混合培养的最适发酵温度应综合考虑酸度、黏度和产品风味而定。由图3、图4可以看出40℃下发酵乳的酸度和黏度都高于其他温度，同时从正交实验结果来看，KA2＞KA1＞KA3，因此确定A2（40℃）为最佳水平。
2.2.2 加糖量
加入一定量的蔗糖是为了降低发酵乳的酸味感觉，使其口味更柔和，更易被消费者所接受，但蔗糖会增加原料乳中溶质的反渗透作用，从而影响甚至抑制发酵菌种的增殖，延长发酵时间。根据感观评定，KB2＞KB3＞KB1，所以可以选取B2（8%）为最佳水平。
2.2.3 接种量
总接种量的大小影响发酵乳的凝乳时间和风味物质的形成。接种量过少，凝固时间延长，风味变劣；接种量过大，会使产酸过快，造成凝乳中蛋白质内脱水收缩现象，乳清析出较多，反而使产品组织状态有粗糙的沙粒感。本实验通过正交分析得到KC2＞KC3＞KC1，可见C2（4%）为最佳水平。
2.2.4 菌种比例
混合菌种发酵可以改善单纯嗜酸乳杆菌发酵乳酸涩味的缺陷，也可以提高单纯嗜热链球菌发酵乳的酸度，使产品酸甜适口，风味纯正。由正交分析得到KD3>KD2>KD1，可见3个水平中，D3（1∶4）为最佳水平。
综上所述，2菌混合发酵条件的最优组合是A2B2C2D3，即加糖量为8％，嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌比例为1：4，接种量为4％，发酵温度为40℃。
2.3 产品在贮存期的变化
发酵乳在低温下流通销售，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌活性降低，代谢受到抑制，但其新陈代谢并未停止。随贮存时间的延长，发酵乳的酸度不断增加，pH值不断下降，活菌数降低。
2.3.1 贮存期间酸度和pH值的变化
贮藏期间发酵乳发生后酸化，嗜酸乳杆曲利嗜热链球曲继续生长繁殖，分解乳糖产生乳酸，使其酸度不断升高，pH值不断下降。由图5可以看出，前5天内酸度上升较快，达到1030T，以后上升较为缓慢，第9天达到1050T后趋于平衡。如图6所示，发酵刚结束时，其pH值为4.58，第二天下降为4.28，以后逐渐下降，第7天为4.11，以后趋于平衡。
2.3.2 贮存期间活菌数的变化
发酵乳在低温贮存期间，酸度不断增加，pH值不断降低，这在一定程度上抑制了菌体的生长，甚至死亡，因而，活菌数不断减少。
如表2所示，发酵乳在4℃条件下，低温使菌种代谢活动减慢，发酵得到有效控制，活菌数不断下降，但嗜酸乳杆菌仍保持了较高的数量，在第3～5天活菌数在108cfu/ml以上，2菌比例在1∶1左右。第11天时，活菌数仍在107cfu/ml以上，并且杆球菌比例仍在1∶1～1∶2之间。嗜酸乳杆菌存活率高于嗜热链球菌，是因为嗜酸乳杆菌具有较强的耐酸能力。
3 结论
1.嗜酸乳杆菌具有良好的发酵特性，在灭菌脱脂乳中发酵8h酸度达到79.30T，活菌数高于109cfu/m1，说明可以用于发酵乳的生产。
2.由正交试验极差分析可知，嗜酸乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵影响产品质量的因素依次为发酵温度、加糖量、接种量和菌种比例。通过正交试验优化出的最佳工艺为：发酵温度为40℃，加糖量为8％，接种量为4％，菌种比例为1∶4。
3.采用上述最佳工艺发酵制作的嗜酸乳杆菌发酵乳在4℃下贮存11d，酸度适宜，活菌数高于107cfu/ml，杆球菌比例均衡，仍具有良好的食疗保健作用。◇
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