近年来由于功率超声设备的普及和发展,超声波对反应过程的影响正引起人们强烈的兴趣和高度重视.研究表明,合适强度的超声波作用于生物反应培养,可提高生物反应的速度,缩短反应时间,提高产品质量和产量[1].当超声波施加于混合相体系时,具有搅拌、促进悬混、均化、乳化等作用,甚至可以影响到化学反应或生物化学反应的进行[2].在微生物发酵过程中,利用超声波可改变固、液、气三相混合状态,改变底物的物理状态或分子结构,使得其容易被微生物利用,从而提高工业发酵或生物化工过程的效率.低强度超声通过空化产生的微射流可使细胞膜通透性增加,促进离子和代谢产物的跨膜扩散.超声作用能使细胞膜的微孔寿命变长或直径增大,这样营养物质就会很顺利地进入细胞内,同时微生物代谢产物也能迅速分泌到体外,不至于造成代谢产物在体内堆积,抑制产物生成,从而达到提高产量的目的.超声波作用后,还会引起细胞膜电位的改变.通过对细胞电生理的研究,某些离子通道的闭合或开启,导致膜内外离子浓度的变化,从而引起膜电位的改变,使细胞中内源生长素及其有关影响生长的物质发生定向迁移,并且影响膜的通透性,从而改变细胞吸收和转运物质的能力,促进了代谢物质的分泌.超声波对有机溶剂中碱性蛋白酶催化N2乙酰2苯丙氨酸乙酯(APAee)的转酯反应进行了研究,超声处理可增强碱性蛋白酶的活性.ElpinerIe等人研究了微弱的超声波空穴作用对细胞产生的破坏很小,能促进可逆渗透,从而加强细胞的物质运输;大量研究表明,超声波还表现出对细胞内酶生产的协同加速作用[3].
本实验以产胆固醇氧化酶短杆菌DGCD2(Brevibacteriumsp.)、红曲霉YHQ70(Monascussp.)、虎奶菇和乳酸脱氢酶菌株为出发菌株,研究超声处理条件对菌体生产和代谢产物合成的影响,分析超声处理影响菌体代谢的原因.为推动超声波在发酵工业中的应用起到积极作用.
1 材料与方法
1.1 材料
产胆固醇氧化酶短杆菌DGCD2(Brevibacteri-umsp.),红曲霉YHQ70(Monascussp.);虎奶菇YHNG01[pl℃urotustustuber-regium(Fr)sing],乳酸脱氢酶菌株,本实验室保藏.分析用试剂为国产或进口分装,AR.
1.2 仪器
HYG-II型回转恒温调速摇瓶柜,上海欣蕊自动化设备有限公司;台式高速离心机TGL-16G,上海医用分析仪器厂;H66MC型超声波发生器,无锡超声设备有限公司;UV-754分光光度计,上海分析仪器总厂;CF702高速冷冻离心机,日本日立公司;303-B2型电热隔水式恒温培养箱,通州市沪通制花机械设备厂;精密数量酸碱计,上海天达仪器有限公司;电热恒温水浴锅,上海医疗器械五厂.
1.3 方 法
1.3.1 DGCD2菌体培养和酶活测定
见参考文献[4].
1.3.2 红曲霉YHQ70菌体培养和MonacolinK含
量测定
见参考文献[5].
1.3.3 DGCD2菌体培养和酶活测定
见参考文献[6].
1.3.4 菌体干重的测定
取10mL充分振荡均匀的发酵液,8000r/min离心10min,弃去上清液后,用0.7%生理盐水洗涤3次,在80℃烘干至恒重,称重,得到10mL发酵液含干菌体重W1,然后换算成每升发酵液中干菌重:W1x100(g/L).
1.3.5 超声波处理方法
用20kHz,工作电压200V条件照射,采用5~10W/mL的剂量处理细胞.以40min照射作为起始剂量对照.
1.3.6 染色体DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳
见参考文献[7].
1.3.7 发酵色素的测定
黄色素、红色素的测定参见参考文献[8].
1.3.8 MonacolinK含量测定
HPLC法测定:HP1100液相色谱仪;
色谱柱:C18,250mmx46mm,粒径5um;
流动相:V(乙腈)/V(0.1%磷酸)=65/35,流速1.0mL/min,检测波长238nm,进样量为20uL.
将发酵液离心,上清液用6mol/mL盐酸酸化至pH3,以等量乙酸乙酯充分抽提2次,抽提液用5%NaHCO3洗涤,经无水硫酸钠干燥后,于50℃减压浓缩,获得的残渣溶于甲醇,经0.45um滤膜过滤后上柱测样.
2 结果与讨论
2.1 超声波对厌氧细菌乳酸脱氢酶分泌的影响
细菌产生的乳酸脱氢酶为胞内酶,提取困难,破壁会造成酶的损失和部分酶失活.而采用超声波对发酵的过程进行处理,可获得部分分泌的效果.在发酵培养12h后开始超声波照射,在16h和20h再照射2次,发酵24h结束,取样分析测定.结果见图1.结果显示,在超声波处理1min左右,乳酸脱氢酶已部分分泌于胞外,发酵液酶活达到0.332U/mL.这是由于超声波处理改变了细胞膜的通透性,和YoshioIshimoyi等人报道的超声波对黑曲霉作用,促进葡萄糖氧化酶分泌的结果相类似.
2.2 超声波对短杆菌产胆固醇氧化酶的影响
短杆菌产胆固醇氧化酶需要胆固醇诱导,胆固醇在体系中分散效果差,常用的方法是加入吐温-80等乳化剂,但添加乳化剂不利于微生物生长,限制了产物的生成,影响产物的后提取.超声波施加于混合相体系时具有促进乳化的作用,有望提高胆固醇的利用率和胆固醇氧化酶的发酵单位.在发酵培养12h开始超声波处理,每隔4h一次,发酵36h结束,取样分析测定,结果见如图2.
结果显示,在超声波处理1min左右,酶活力增加100个单位;超过2min,产量明显下降;另外实验中发现,超声波处理后菌体量没有明显增加.配制发酵培养基,用超声波协同吐温280乳化,在频率20kHz功率5W/mL分别处理5、10、15、20、25、30min.再接种,发酵36h结束.取样分析测定酶活和培养基胆固醇的浓度中,结果见图3.结果显示,当超声波剂量为5.0W/mL,作用培养基15min左右,酶活有明显的提高,而发酵液中胆固醇残留量减低.
综合图2和图3进行分析,可以认为超声波对短杆菌产胆固醇氧化酶的影响是通过对菌体代谢的影响和增加胆固醇在体系中的乳化性,提高胆固醇的利用率实现的.
2.3 超声波对红曲霉MonacolinK色素产量的影响用20kHz,2.5W,按照不同超声波作用时间每隔8h作用1次,培养1周后采集样品,分析测定Mona2colinK色素的产量.结果见图4.
结果显示,超声波处理时间会影响MonacolinK产量.较长时间会引起细胞死亡率升高,从而导致色素和MonacolinK产量下降.而处理时间过短又达不到刺激其产色素和MonacolinK的效果,照射剂量为2.5W/mL,作用时间为2min左右时效果最明显,提高幅度在30%左右.为了研究超声波对不同生长阶段微生物的影响,实验中选取迟滞期、对数生长期、平衡期及衰老期的时间段对红曲霉菌进行超声波处理,超声培养后取样测定,结果如表1所示.
由表1可以看出,在细胞迟滞期加以超声波照射,对菌丝体生长有所限制,直接导致色价和Mona2colinK产量降低,在对数生长期对细胞生长影响不大,而且色价和MonacolinK产量都有大幅度提高,分别达29.74%和39.96%.
红曲霉为好气性菌,它的耗氧量随着它的生理状态的不同而异,其细胞的生长与色素的形成都需要有足够的氧气,为达到最高的色素和MonacolinK产量与最低的动力消耗,供给适宜的溶解氧是极为重要的.正常情况下红曲霉摇瓶培养菌落呈团状,不利于对氧和营养物质吸收,也不利于代谢物质分泌.采用超声波处理可以使菌丝体分散,甚至是游离的单菌体,克服了对菌体生产及色素生成的限制,从而有利于菌体的代谢和产物量的提高.也可能是超声改变了菌丝细胞的通透性,从而增加其分泌,达到提高其胞外色素和MonacolinK产量.同时超声波处理可以使发酵液粘度降低,物质混合均匀,有利于氧气及营养物质的传递,更重要的是便于色素的分离和提取.
红曲霉菌发酵以淀粉作为底物,为了研究超声波处理对大分子底物的影响,配制发酵培养基,在频率20kHz功率5W分别处理5、10、15、20、25、30min.培养1周后采集样品,分析测定MonacolinK色素的产量.结果见图5.
从图5可以看出,随处理时间的增加色素产量有所提高,20min左右时提高幅度最大,提高25%左右,超过20min时产量基本维持在恒定水平,说明超声对培养基的分散作用20min是最适时间.超声波处理时间影响MonacolinK产量.作用时间超过20min时效果明显,提高幅度40%左右,超过20min没有明显的变化.对于产量的提高,可以设想为在红曲霉发酵的过程中,以淀粉作为底物,超声波作用改变了淀粉的形态结构,提高微生物对底物的利用率,从而提高产量.
2.4 超声波照射对虎奶菇菌体干重及多糖产量的影响500mL三角瓶装液量为100mL,发酵培养基接种后,在25℃,pH6.5,转速为160r/min条件下培养6d,培养过程中用20kHz,200W,工作电压200V条件照射,按照不同超声作用时间(20min,10min,5min,2min,1min,30s,10s)平行对照,对起始培养基及发酵过程进行处理,每隔8h作用1次,培养6d,菌体干重及多糖产量测定结果如表.
从表2结果可以看出,产量没有明显的变化,只是在1~2min时略有提高.这可能是由于虎奶菇菌丝体细胞壁要比一般真菌要坚固,同时虎奶菇菌丝体在液体深层发酵培养中菌丝形成菌胶团,结构比较致密,当超声强度很低时,对菌胶团影响不是很大,当超声强度很大时,又会将菌丝打断,影响其生长,直接导致多糖产量的降低.
3 结 论
(1)对淀粉为碳源的红曲霉MonacolinK发酵过程中进行超声波处理,结果红曲色素色价和提高了25%左右.
(2)对于小分子固形物胆固醇作为底物的工业发酵,超声波处理所产生的搅拌作用和乳化作用使固形物在乳化体系中稳定分散,从而有效地提高底物利用率.
(3)超声波对乳酸菌生成乳酸脱氢酶发酵过程进行处理,结果原先不可分泌的乳酸脱氢酶渗漏到胞外.胞外酶活达0.332U/mL.
(4)超声波处理对产胆固醇氧化酶短杆菌DGCD2(Brevibacteriumsp.)和红曲霉YHQ70(Monascussp.)有明显的诱变作用.甾短杆菌经超声处理诱变后的酶活比出发株提高了31.74%,菌体的生物量没有明显提高;红曲霉菌经超声处理诱变的菌种,菌丝体生长受到一定的限制,色价和MonacolinK产量分别提高30%和40%左右.
参考文献
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