利普司他汀(lipstatin)是毒三素链霉菌(streto myces toxytricini)的代谢产物,能选择性抑制胃肠道中胰脂肪酶的活性,减少脂肪的分解和吸收.其四氢衍生物奥利司他(ｏｒｌｉｓｔａｔ)已被罗氏公司(Ｒｏｃｈｅｌｎｃ)成功开发为减肥药———赛尼可[1],是目前唯一一个作为非中枢神经系统作用而上市的治疗肥胖症的药物[2].因而,发酵法生产利普司他汀备受关注.提高利普司他汀的发酵生产水平,主要依赖于菌种选育和培养基组成及发酵工艺条件的优化.本文采用的利普司他汀菌种经多次推理选育,所获得的突变株ＸＣ-ｌｐ-69发酵水平较原始菌株提高了3倍.通过开展利普司他汀发酵培养基和发酵条件的优化,以及补料工艺的研究,在最适条件下,利普司他汀的发酵效价由原工艺的310μｇ·ｍＬ-1提高到1400μｇ·ｍＬ-1
1 材料与方法
1.1 菌种毒三素链霉菌(streto myces toxytricini)Xc-lp-69,系浙江医药股份有限公司新昌制药厂提供.
1.2 培养基
(1)斜面培养基(ｇ·Ｌ-1):可溶性淀粉10.0,蛋白胨5.0,ＫＮＯ32.0,ＮａＣｌ2.0,ＫＨ2ＰＯ42.0,琼脂20.0,去离子水配制,ｐＨ6.8～7.0.
(2)母瓶/种子培养基(ｇ·Ｌ-1):冷榨黄豆饼粉15.0,甘油15.0,酵母膏7.5,豆油5.0,ＫＮＯ32.0,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ1.0,自来水配制,ｐＨ7.0～7.2.(3)发酵培养基(ｇ·Ｌ-1):冷榨黄豆饼粉30.0,甘油20.0,大豆卵磷脂12.0,酵母粉10.0,豆油5.5,自来水配制,ｐＨ7.0～7.2.
1.3 培养条件
(1)斜面培养条件:培养温度30℃,相对湿度35%～50%,培养周期120～150ｈ.
(2)种子培养条件:培养温度27℃,250ｍＬ三角瓶装量25ｍＬ,摇床转速240ｒ/min,培养时间20～24ｈ.
1.4 发酵工艺优化试验不同培养温度,种子不同种龄和不同的接种量对利普司他汀发酵单位和发酵液ｐＨ值的影响;以250ｍＬ三角瓶中不同装料量模拟溶解氧浓度的变化试验对发酵的影响;发酵至40ｈ以后,每次补入一定量的豆油与甘油2∶1体积比的混合物,补到发酵96ｈ为止,观察对发酵的影响.
1.5 测定方法
(1)ｐＨ测定:用酸度计测定.
(2)利普司他汀发酵单位测定试样制备:取发酵液3ｍＬ,加6ｍＬ丙酮,摇匀,室温浸泡1ｈ,3500ｒ/min离心10min,吸取1.0ｍＬ上清夜,10000ｒ/min离心10min,上清液用于ＨＰＬＣ分析.
ＨＰＬＣ色谱条件:色谱柱Ｃ18ＯＤＳ(4.6ｍｍ×250ｍｍ),柱温35℃,检测器ＤＡＤ(ＨＰ1100),检测波长210ｎｍ,流动相为乙腈∶水=86∶14,流速0.8ｍＬ·min-1.
2 结果与讨论
2.1 菌株Xc-lp-69发酵培养基优化
有关lipstatin生物合成的文献[3,4]报道,油脂(特别是富含亚油酸的)经菌体代谢生成用于利普司他汀合成的前体:14Ｃ和8Ｃ烃链以及亮氨酸.依据前期试验结果,设计了四因子三水平正交试验,优化发酵培养基,试验结果如表1所示.
Ｘ1ｊ,Ｘ2ｊ,Ｘ3ｊ分别表示各因素1,2,3水平的平均相对效价;Ｒ表示各因素不同水平之间相对摇瓶效价最高值与最低值之差.
表1数据和统计结果表明,对毒三素链霉菌Xc-lp-69发酵,培养基中豆油的加量影响最大,以豆油5.5%为最佳.四种因素影响大小依次为豆油>黄豆粉+酵母粉>甘油>卵磷脂.采取各因素的最佳水平组成的培养基配方为豆油5.5%,甘油2.0%,黄豆粉3.0%,酵母粉1.0%,卵磷脂1.2%.
对上述优化的发酵培养基配方进行了摇瓶重复试验,与对照组比较,利普司他汀的平均相对效价为121.5%,说明了该配方为菌株Xc-lp-69较为适宜的发酵培养基,适合于利普司他汀的生物合成.以此培养基配方为基础进行发酵水平和培养条件优化试验.
2.2 温度对利普司他汀发酵的影响
将25℃,27℃培养的种子液接入发酵瓶(250ｍＬ三角瓶装量25ｍＬ发酵培养基,接种量3.0%)分别置于25℃,27℃,29℃条件下,转速240ｒ/min,发酵5ｄ,试验结果如表2所示.
由表2可知,温度对利普司他汀发酵影响较大温度偏低、偏高,都不利于利普司他汀的生物合成同时,发酵温度对发酵液的ｐＨ值变化影响也比突出,ｐＨ值同样影响发酵效价,故选定种子和发培养温度为27℃.
2.3 种子种龄对利普司他汀发酵的影响
新鲜斜面孢子接种种子培养瓶中,27℃培养观察发酵料液的变化.培养至8ｈ后,可看到料液显液化,镜检可看到菌丝及形成的小团.随时间移,菌丝逐渐增多.19～24ｈ时种子摇瓶具有明且均匀的薄片状挂壁,种液略稠,镜检可观察到壮、舒展、着色深、均匀的网状菌丝.随着培养时间一步延长,到30ｈ以后,种子液颜色加深,开始稀,镜检发现有部分菌丝轮廓变模糊,出现断裂象.考察不同种龄对利普司他汀发酵的影响,其他酵条件同前,试验结果如表3所示.
由表3结果可知,适宜的种龄为20ｈ.
2.4 接种量对利普司他汀发酵的影响
按2.0%,4.0%,6.0%,8.0%,10.0%的接种量接入250ｍＬ三角瓶(内装25ｍＬ发酵培养基),进行发酵培养,其他条件同前,结果如表4所示.
由表4结果可知,最佳接种量为2.0%.接种量大可能造成菌浓大,营养不足,菌丝提前自溶,引起发酵液的ｐＨ上升,从而影响产物的稳定性.
2.5 溶氧对利普司他汀发酵的影响以摇瓶的不同装料量(250ｍＬ三角瓶分别装15ｍＬ,20ｍＬ,25ｍＬ,35ｍＬ,45ｍＬ发酵培养基)模拟溶解氧浓度的变化,其余发酵条件同前,考察溶氧浓度对发酵的影响,结果如表5所示.
微生物以油脂作碳源时耗氧量大,如果发酵过程中供氧不足,会导致有机酸积累,使发酵液ｐＨ降低.表5的试验结果亦表现出此种规律.当装量45ｍＬ时,发酵液的ｐＨ值低于5.0,是溶氧不足造成的,既影响菌体生长,又影响产物合成.装量少,由于发酵液的蒸发浓缩作用易导致菌体生长不良,并提前自溶,发酵液ｐＨ显著升高,进而导致产物降解.从表5结果可知,250ｍＬ三角瓶装量25ｍＬ较适于产物合成,表明利普司他汀发酵过程要求较大的溶氧浓度.经上述优化试验,利普司他汀最适发酵工艺条件为:温度27℃,种龄20ｈ,接种量2.0%,装量25ｍＬ,在这些最适条件下,其发酵效价为1134μｇ·ｍＬ-1.
2.6 补料试验
2.6.1 豆油/甘油混合物补加时间对利普司他汀发酵的影响
利普司他汀发酵需要一定的溶氧浓度,而发酵培养基中碳源主要是豆油.但当豆油浓度偏大时,培养基粘度会增大,影响发酵过程的传质,特别影响溶氧量,不利于菌丝摄取氧和营养物质,进而影响产物合成.为解决这一矛盾,我们减少基础配料中豆油的含量(从5.5%减至3.5%),在不同时间补加豆油/甘油2∶1体积比混合物2.5%,考察补料时间对利普司他汀发酵的影响,以不补料配方为对照,结果如图1.
由图1可知,在发酵初期补加豆油/甘油混合物,对发酵并不有利.但发酵至20ｈ以后加入豆油/甘油混合物,对利普司他汀生物合成有明显的促进作用.特别是在46ｈ补入对其发酵最为有利,可能此时培养基中的碳源已被菌体多数利用.在此后补入则效果变差.
2.6.2 豆油/甘油混合物加量对利普司他汀发酵的影响
按上述试验方法,在发酵培养至46ｈ时补入不同浓度的豆油/甘油混合物进行试验,以不补料配方为对照,结果如图2所示.
图2结果表明,每次补入一定量的豆油/甘油混合物,利于产物的生物合成.豆油/甘油补加量在3.0%以下时,随培养基中豆油/甘油混合物的加入发酵效价增加,加量为3.0%时,发酵效价最高,继续增加豆油/甘油的浓度相对效价反而降低,从而选定加量为3.0%质量分数.
2.6.3 补料与不补料工艺的比较
补料与不补料工艺发酵结果如图(3—5)所示.比较发现,补料可提高利普司他汀的效价25%,菌丝形态好,菌丝量明显多,发酵ｐＨ稳定.
3 结论
(1)经正交试验优化,利普司他汀的发酵培养基配方为:豆油5.5%,甘油2.0%,黄豆粉3.0%,酵母粉1.0%,卵磷脂1.2%.
(2)利普司他汀发酵的最佳工艺条件为:温度27℃,种龄20ｈ,接种量2.0%,装量25ｍＬ,在这些最适条件下,其发酵效价为1134μｇ·ｍＬ-1.
(3)补料试验表明,在发酵46ｈ时补加入3.0%质量分数的豆油/甘油2∶1体积比混合物,可提高效价25%,达1400μｇ·ｍＬ-1.
