【摘要】 目的 用大孔树脂法代替溶媒萃取法分离纯化洛伐他汀。方法 采用大孔阴离子交换树脂D?273作吸附剂，洛伐他汀发酵液预处理后树脂吸附流速1/30(BV/min)；解吸采用添加4%氢氧化钠的75%乙醇，流速1/100(BV/min)。结果 洛伐他汀收率达68%以上，产品质量符合美国药典USP27版规定。结论 大孔树脂法在降低生产成本和提高操作安全性上明显优于溶媒萃取法，值得在工业生产上推广。
【关键词】 浙江瑞邦药业有限公司， 温州325027
洛伐他汀(lovastatin)是目前临床上重要的降血脂药物，是由真菌产生的一种甲基羟二戊酰辅酶A(HMG?CoA)还原酶抑制剂。1979年Endo等［1］首次报道从红曲霉的发酵液中发现此物质，随后Alberts等［2］于1980年报道了洛伐他汀的新产生菌——土曲霉(Aspergillus terreus)，并实现了产业化。洛伐他汀具有极性弱，难溶于水，溶于低级醇、酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、苯、甲苯，不溶于石油醚，正已烷。据此分离纯化一般多用溶媒萃取法［3，4］，但此法耗用大量溶媒，成本较高，经多次转提，收率较低。我们尝试根据洛伐他汀结构中具有羧酸基团的特性，采用大孔阴离子树脂动态吸附、解吸工艺提取纯化洛伐他汀。
1 材料与方法
1.1 实验材料
发酵菌种采用本公司生产的洛伐他汀生产菌种土曲霉WY9308VS。
乙酸乙酯、乙酸丁酯、丙酮、甲醇、乙醇为分析纯(南京化学试剂厂)；盐酸、氢氧化钠为化学纯(上海化学试剂采购供应站)；大孔树脂选用D?201、D?202、D?273、D?293、D?301、D?315和D?345(华东理工大学华震公司)共7种。
主要设备包括SHB?3型循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司)；R?201型旋转薄膜浓缩仪(上海申胜生物技术有限公司)；HPLC510泵486检测器(美国Waters公司)；PHS?3C酸度计(上海雷磁仪器厂)；ZK?82B电热干燥箱(上海实验仪器厂)；Φ30mm×400mm玻璃吸附柱(上海玻璃仪器厂)。
1.2 方法
1.2.1 发酵液预处理方法 由于洛伐他汀在发酵液中以洛伐他汀羧酸形式存在于菌丝体内，在加入氢氧化钠的碱性条件下可以洛伐他汀酸钠的形式而溶于水。根据这一特性，以6mol/L氢氧化钠调整发酵液的pH至9～13，考察不同pH条件和搅拌时间对洛伐他汀溶出率的影响。以pH3.0搅拌120min条件下的洛伐他汀溶出率作为对照。
1.2.2 大孔阴离子树脂的筛选 根据洛伐他汀具有羧酸基团的特性，选用大孔阴离子树脂D?201、D?202、D273、D?293、D?301、D?315和D?345进行静态吸附筛选。
1.2.3 大孔阴离子树脂的预处理和再生方法 将准备装柱使用的新树脂，用2倍左右体积的乙醇浸泡2h，并不时搅动，除去色素和杂质，用离子水洗涤后装柱，以1/15～1/20(BV/min)的流速，将4倍体积的1mol/L的氢氧化钠溶液通过树脂层，用离子水洗涤至流出液呈中性。再将4倍体积的1mol/L的盐酸溶液通过树脂层，用离子水洗涤至流出液呈中性。再次将4倍体积的1mol/L的氢氧化钠溶液通过树脂层，用离子水洗涤至流出液呈中性备用。树脂的再生方法与上述预处理方法相同。
1.2.4 树脂的动态吸附和解吸
吸附 取己预处理的树脂200ml，将预处理过的发酵滤液从柱顶通入，流速为1/30(BV/min)，以50ml为一个体积分部收集，测定浓度，计算吸附容量。
解吸 柱床洗涤后，用适当解吸液洗脱洛伐他汀酸，流速为1/100(BV/min)，以50ml为一个体积分部收集，测定浓度，计算解吸率。
1.2.5 溶媒法萃取工艺 将至发酵终点的发酵液用6mol/L盐酸调pH至3.0，搅拌120min后过滤，取菌丝体加入3倍体积的乙酸丁酯进行萃取，重复萃取两次，合并乙酸丁酯萃取液，于50～60℃减压浓缩，浓缩液于0～10℃结晶，离心分离结晶体，粗结晶于50～60℃真空干燥，用丙酮再次结晶，并经无水乙醇重结晶后，成品于50～60℃真空烘干。
1.2.6 洛伐他汀浓度的测定方法
HPLC法测定样品中洛伐他汀的浓度［5］ 取样品液1.00ml用无水乙醇稀释至待测浓度。以洛伐他汀对照品的无水乙醇溶液(300μg/ml)为对照计算浓度。
色谱条件 Agilent Zorbax SB C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙酸∶水∶甲醇(2.4∶400∶2000)；柱温25℃；检测波长238nm；流速1.5ml/min。
1.2.7 成品质量分析 对采用大孔吸附树脂工艺获得的连续5批小试成品，按美国药典USP27版的规定［6］进行检测，并与采用溶媒萃取工艺的5批小试成品的检测结果进行比较。
2 实验结果
2.1 发酵液预处理方法的研究
发酵液在不同pH和搅拌时间下对洛伐他汀相对溶出率的影响结果见Tab.1，显示洛伐他汀的最佳溶出条件为pH11.0，搅拌时间90min。本工艺的相对溶出率与溶媒法工艺在pH3条件下的相对溶出率相当。
2.2 最佳吸附条件的研究
2.2.1 树脂的选择 筛选用7种树脂对洛伐他汀酸的吸附量见Tab.2。结果显示，强碱树脂吸附性能明显优于弱碱性树脂，其中D?273具有最佳吸附性能，因此确定D?273树脂进行最佳工艺的研究。
2.2.2 最佳吸附流速 考虑到洛伐他汀在碱性条件下的降解，故对在pH11条件下预处理后的发酵液用6mol/L的盐酸调节pH至8.0。以洛伐他汀浓度为5,130mg/L的预处理液上柱，比较1/15、1/30和1/45(BV/min)时的吸附性能，结果见Tab.3。结果表明，流速越慢，吸附越好。但考虑到洛伐他汀的稳定性及流速过慢会延长生产周期，提高成本，因此选用中速1/30(BV/min)为实验吸附流速。
2.3 最佳解吸条件的研究
2.3.1 解吸溶剂的静态筛选
选用甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯等五种溶剂进行筛选。结果表明，乙醇和甲醇具有较好的解吸能力，而乙醇毒性大大低于甲醇，故选用乙醇作为解吸剂。
2.3.2 最佳解吸条件 为提高解吸收率，使洗脱峰集中，根据洛伐他汀钠易溶于水的特点，用不同浓度的氢氧化钠溶液和乙醇的混合液解吸，其对解吸率和解吸体积的影响见Tab.4。结果表明，采用含4%氢氧化钠的75%乙醇进行洗脱时洗脱峰最集中，收率最高。而更高浓度的氢氧化钠由于碱性过大，破坏了洛伐他汀，收率明显降低。
2.4 实验室规模放大试验工艺流程
根据上述试验结果，确定如下最佳工艺流程。首先将发酵液用6mol/L氢氧化钠溶液调至pH11.0，搅拌90min，抽滤，并用50%发酵液体积的pH11.0的碱水顶洗，得滤液，滤液用6mol/L的盐酸调至pH7～8；用经预处理后的D?273树脂吸附，流速1/30(BV/min)，用水洗涤两倍树脂体积，用两倍树脂体积的75%乙醇(含4%氢氧化钠)解吸，流速1/100(BV/min)，边解吸边用6mol/L的盐酸将解吸液的pH调至7～8，解吸完毕后，解吸液于50～60℃真空浓缩回收乙醇；浓缩液转移到分液漏斗调pH2.5～3.0，加入等体积乙酸丁酯进行萃取，萃取液于50～60℃减压浓缩；浓缩液于0～10℃结晶5～10h，抽滤得粗品；粗品于50～60℃真空烘干，用丙酮结晶一次，再用无水乙醇重结晶得成品。该试验工艺的总收率达68%。
2.5 成品质量分析
所得洛伐他汀产品为白色针状结晶，无臭、无味。连续5批小试成品的主要指标见Tab.5，均符合美国药典USP27版规定。
2.6溶媒法和树脂法提取工艺的成本、质量及收率比较
采用本研究确定的树脂法提取工艺，与传统的溶媒法萃取工艺进行比较，树脂法在有机溶剂使用量和总成本(Tab.6)方面均明显优于溶媒萃取法，成品质量不低于溶媒萃取法而提取平均收率略高于溶媒萃取法(Tab.7)。
3 结论
大孔树脂法较溶媒萃取法提取洛伐他汀有以下显著优点：采用阴离子大孔树脂的D?273吸附洛伐他汀，减少了大部分色素和杂质的吸附，因而洗脱液质量好，洗脱高峰集中，洗脱液体积仅为树脂柱体积的2.5倍量，解吸收率高；大孔树脂工艺摒弃了大量溶媒，大大减少了萃取液的浓缩量，既节约了能源和溶媒的损耗，也减少了由于浓缩过程带来的热破坏，生产成本大大降低，简化了设备和安全设施投入，提高了生产安全性，在当今能源和石化产品价格据高不下的年代具有一定的应用价值。大孔树脂法在过滤和树脂吸附及解吸过程中要求生产必须连贯迅速，过程的延误会造成洛伐他汀在碱性条件下过多地降解，若发生停电、停水等情况时存在收率降低的风险。
【参考文献】
［1］ Endo A. Monacolin K, a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species ［J］. J Antibiot,1979,32(8):852
［2］ Alberts A W, Chen J, Kuron G, et al. Mevinolin: a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutaryl?coenzyme A reductase and a cholesterol?lowering agent ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,1980,77(7):3957
［3］ Hajko P, Vesel T, Ivan P. Process for the isolation of lovastatin ［P］. US: 5712130,1998?7?27
［4］ Kumar P, Raman S, Norula P, et al. Process for the isolation of lovastatin ［P］. US: 7052886,2006?5?30
［5］ 文镜，刘迪，金宗濂. 洛伐他汀检测方法研究进展［J］. 北京联合大学学报，2003，17(3)：71
［6］ United States Pharmacopeial Convention Inc. The United States Pharmacopoeia XXVII ［S］. Taunfon: Rand McNally,2004:1109
