药用真菌Cv优质菌株诱变育种和营养条件的初步研究
盛丽君
摘要：将Cv出发菌株进行紫外诱变处理，以生长速度为指标进行初筛，结果在37株诱变株中选出8株生长速度较快的菌株，进一步通过深层发酵培养进行复筛，分析这8株初筛诱变株的菌丝体生物量和胞内多糖产量，胞内多糖得率最高的菌株分别是Cv-2和Cv-5，但考虑到Cv-2的菌丝体干重明显小于Cv-5，故选Cv- 5为优选菌株。研究不同碳、氮源对诱变株Cv-5菌丝体生物量和胞内多糖产量的影响，认为玉米粉、淀粉是较好的碳源，黄豆饼粉、硝酸钾是较好的氮源。对碳、氮源和无机盐的主要影响因素进行正交试验以及均匀试验后，确定最有利于菌丝体生长的培养基的最佳配比为：玉米粉2.5% 、黄豆饼粉1.0% 、硝酸钾0.3% 、MgSO4 · 7H20 1.3%、KH2PO4 1.3%，菌丝体生长量达1225.0mg/100ml。最适宜胞内多糖合成的培养基的最佳配比为：玉米粉2.5% 、黄豆饼粉1 .0% 、硝酸钾0.3% 、MgSO4·7H20 0.3%、KH2PO4 1.1%，胞内多糖产量可达99.0mg/100ml。
关键词：Coriolus vesicolor；紫外诱变；碳氮源试验
A Preliminary Study on the Breeding and Nutrition Condition
Of Coriolus vesicolor
Abstract: Coriolus vesicolor was treated with uv-irradiation, and 8 strains were selected by comparing their mycelial growing speeds from 37 strains. After submerged cultivated, those 8 strains were analyzed about their mycelial growth and intracellular polysaccharides. The results showed that No.5 was better in mycelial growth and intracellular polysaccharides production. After the effects of different carbon and nitrogen sources on mycelial growth and intracellular polysaccharides were studied, it was found that corn powder、starch、bean meal、Potassium Nitrate were the better carbon and nitrogen sources for the mycelial growth and intracellular polysaccharides. After the orthogonal test and the uniform design, the best composition of medium for the mycelial growth was thought as 2.5% corn powder、1.0% bean meal、0.3% Potassium Nitrate、1.3% MgSO4·7H20、1.3% KH2PO4 , the output of mycelial growth was 1225.0mg/100ml. The best composition of medium for intracellular polysaccharides was thought as 2.5% corn powder、1.0% bean meal、 0.3% Potassium Nitrate、0.3% MgSO4·7H20、1.1% KH2PO4 ，the output of intracellular polysaccharides was 99.0mg/100ml.
Key words: Coriolus vesicolor ; uv-irradiation; carbon and nitrogen test
0 引言
真菌不但是我国天然药物资源和中草药的一个极为重要的组成部分，而且已成为当今探索和发掘抗癌药物的重要领域。自从1951年美国人Reilly H 首次发现担子菌有抑癌活性以来，特别是日本学者千原于1969年报道了香菇抗肿瘤多糖之后，在全球范围内掀起了一场从食药用真菌中寻找抗癌药物的热潮，迄今为止已证明100多种真菌具有显著的抗肿瘤活性[1-6]。已研究开发的真菌多糖产品有：香菇多糖、灵芝多糖、云芝多糖、金针菇多糖、竹荪多糖等[1-9]。
云芝又称彩色云芝、采绒革盖菌(Coriolus vesicolor)，隶属于灵芝科，已报道有日本的“PSK”[10]、中国的“PSP”、云芝多糖、云星等多种产品上市，它们不仅给肿瘤患者带来了福音，也给生产厂家带来了巨大的经济效益和社会效益。
优质菌种是产品研发的基本前提。常见的担子菌菌种选育方法有自然选育、诱变育种、杂交育种等[11-13]，近几年来利用原生质体融合技术和基因工程技术改造菌种的方法也取得了较大的进展，但诱变育种仍是一个有效的方法[14-19]。在紫外线诱变育种的过程中，最适宜的诱变对象是单细胞、单核的个体，但担子菌孢子的获得往往受到季节的限制。因此对于不易获得孢子或孢子不易萌发的菌种，可对其菌丝片段进行诱变处理，以获得优质菌株[20]。
本研究对一株云芝出发菌株进行了紫外诱变育种，以期获得深层培养时菌体生长量多，胞内多糖产量高的优质菌株。同时还初步研究了其中一株优质菌种的深层发酵营养条件，进一步提高云芝多糖产品的经济效益，提供优质菌株和最佳的营养条件。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
Cv菌株（Coriolus vesicolor）
1.2 培养基
1.2.1 斜面培养基（PDA培养基）
土豆 20%
蔗糖 2%
琼脂 2%
pH 自然
1.2.2 液体培养基
1.2.2.1 种子培养基
玉米粉 3%
蔗 糖 1%
麦芽糖 1%
pH 自然
1.2.2.2 发酵培养基
Ⅰ.葡萄糖 3% Ⅱ.葡萄糖 2%
黄豆饼粉 1% 蛋白胨 0.5%
MgSO4 · 7H20 0.1% MgSO4 · 7H20 1%
KH2PO4 0.1% KH2PO4 2%
pH 自然 pH 自然
Ⅲ.葡萄糖 2% Ⅳ.玉米粉 2.5%
蛋白胨 0.5% 黄豆饼粉 1.0%
MgSO4 · 7H20 0.1% 硝酸钾 0.3%
KH2PO4 0.2% MgSO4 · 7H20 0.1%
pH 自然 KH2PO4 0.1%
pH 自然
1.2.2.3 碳源试验培养基
以发酵培养基Ⅱ为基础，将2%葡萄糖分别替换成：柠檬酸、甘油、蔗糖 、麦芽糖、糊精、淀粉、玉米粉7种碳源进行试验。
1.2.2.4 氮源试验培养基
以发酵培养基Ⅲ为基础，将0.5%蛋白胨分别替换成：牛肉浸膏、酵母粉、麸皮、黄豆饼粉、硫酸铵、硝酸钾6种氮源进行试验。
1.3 培养条件
1.3.1 斜面培养
从原始Cv菌株的斜面中取出约0.5cm2大小的一块菌丝体接种于PDA斜面上，28℃恒温培养5d左右。
1.3.2 液体培养
1.3.2.1 种子培养
将斜面菌种接种于种子培养基后，于28±1℃，140±10rpm的恒温振荡培养器中培养2d。
1.3.2.2 发酵培养
将种子培养物接于发酵培养基中，于28±1℃，140±10rpm的恒温振荡培养器中培养5-6d。
1.4 紫外诱变育种
1.4.1 紫外诱变
在无菌条件下，刮取已活化的菌丝体片段，用2ml的生理盐水洗涤斜面，制成菌丝体悬液，用脱脂棉过滤于装有玻璃珠的锥形瓶中，28±1℃，140±10rpm 摇床上振摇30min后，将菌丝体悬液置于15W紫外灯下30cm处，分别用1″、10″、40″、1′、2′的剂量进行紫外诱变。诱变后的菌液进行梯度稀释后，用移液管吸取适量体积，涂布PDA平皿，28℃避光培养3d后观察结果并记录。
1.4.2 菌株筛选
紫外诱变后，将PDA平皿上直径大，菌丝生长茂盛的菌落转接于PDA斜面中，28℃避光培养，7d后观察并记录各菌丝体的生长长度。将初筛出的生长速度较快的诱变株分别接种于液体发酵培养基Ⅰ中，28±1℃，140±10rpm的恒温振荡培养器中培养6d，分析各诱变菌株的菌丝体生长量和胞内多糖产量。
1.5 分析方法
1.5.1 菌丝体干重
振荡培养后的发酵液抽滤后，获菌丝体和滤液，菌丝体用蒸馏水洗涤抽滤3次后于60℃烘箱烘干至恒重，称得菌丝体干重。
1.5.2 胞内多糖测定
将菌丝体研磨成细粉，加入20ml蒸馏水，95±2℃下水浴浸提3小时后，加入4倍体积的95%乙醇，置于4℃冰箱过夜，4000r/min离心10分钟，弃上清液，沉淀物于60℃烘箱烘干至恒重，称重即为胞内多糖。
1.5.3 多糖得率
多糖得率（%）= 胞内多糖干重/菌丝体干重×100%
1．6 营养条件试验
1.6.1 碳氮源试验
将发酵培养基Ⅱ中的碳源分别替换成2%柠檬酸、甘油、葡萄糖、蔗糖 、麦芽糖、糊精、淀粉、玉米粉，接10%种子培养物，每种碳源作3次重复。28±1℃，140±10rpm振荡培养6d后，测量并比较8种碳素营养对菌丝体干重、胞内多糖产量的影响。
将发酵培养基Ⅲ中的0.5%氮源分别换成蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、麸皮、黄豆饼粉、硫酸铵、 硝酸钾，接10%种子培养物，每种氮源作3次重复。28±1℃，140±10rpm振荡培养5d后测量并比较7种氮素营养对菌丝体干重、胞内多糖产量的影响。
1.6.2 碳氮源的正交试验
将碳氮源单因子试验中，菌丝体生长量大，胞内多糖产量高的4种碳氮源进行L9（34）的9组正交试验，28±1℃，140±10rpm振荡培养6d后，测量并比较各种不同碳氮源因子对菌丝体干重、胞内多糖产量的影响。
1.6.3 无机盐试验
对发酵培养基Ⅴ中的MgSO4 · 7H20 、KH2PO4 进行U7（72）的7组均匀试验，28±1℃，140±10rpm振荡培养6d后，测量并比较各种不同无机盐因子对菌丝体干重、胞内多糖产量的影响。
2 结果与讨论
2.1 Cv出发菌株的诱变育种
2.1 .1 紫外诱变
活化培养后的菌丝片段分别用1″、10″、40″、1′、2′的剂量进行紫外诱变，诱变后的菌液经梯度稀释后涂布PDA平皿，28℃避光培养3d后，进行菌落记数。结果见图1。
图1 紫外照射对Cv菌株的影响
从图1可见：随着紫外照射剂量的增加，菌株的致死率逐渐升高，到2分钟时已达96.65%。
2.1.2 Cv诱变菌株的初筛
当处理剂量大时，杀菌率高（90～99%），在单位存活细胞中负突变菌株多，正突变菌株少。用小剂量进行诱变处理时，杀菌率约为50～80%，在单位存活细胞中正突变株多[21]。所以选取紫外照射1′的诱变菌株（致死率为85.82%）直径大，菌丝生长茂盛的菌落转接于PDA斜面中，28℃避光培养7d后，测量菌丝体生长长度。结果见表1。
表1 Cv诱变株的初筛试验
菌株 Strains 菌丝体生长长度 （mm） 平均长度 （mm） 日生长速度 （mm/d） 差值 (mm)
出发菌株 45 45 45.0 6.43 0.00
1 53 50 51.5 7.36 0.93
2 55 55 55.0 7.86 1.43
3 50 50 50.0 7.14 0.71
4 52 44 48.0 6.86 0.43
5 55 55 55.0 7.86 1.43
6 52 56 54.0 7.71 1.28
7 47 47 47.0 6.71 0.28
8 52 52 52.0 7.43 1.00
9 46 46 46.0 6.57 0.14
10 54 55 54.5 7.79 1.36
11 40 40 40.0 5.71
12 34 38 36.0 5.14
13 53 56 54.5 7.79 1.36
14 38 45 41.5 5.93
15 55 55 55.0 7.86 1.43
16 55 55 55.0 7.86 1.43
17 45 40 42.5 6.07
18 40 43 41.5 5.93
19 54 54 54.0 7.71 1.28
20 30 30 30.0 4.29
21 48 48 48.0 6.86 0.43
22 55 55 55.0 7.86 1.43
23 44 46 45.0 6.43 0.00
24 52 52 52.0 7.43 1.00
25 20 20 20.0 2.86
26 30 42 36.0 5.14
27 52 52 52.0 7.43 1.00
28 48 48 48.0 6.86 0.43
29 48 50 49.0 7.00 0.57
30 43 43 43.0 6.14
31 42 42 42.0 6.00
32 53 55 54.0 7.71 1.28
33 55 55 55.0 7.86 1.43
34 53 52 52.5 7.50 1.07
35 52 50 51.0 7.29 0.86
36 43 43 43.0 6.14
37 42 42 42.0 6.00
由表1可知：在37株诱变株中，Cv-1、Cv-2、Cv-3、Cv-4、Cv-5、Cv-6、Cv-7、Cv-8、Cv-9、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-19、Cv-21、Cv-22、Cv-23、Cv-24、Cv-27、Cv-28、Cv-29、Cv-32、Cv-33、Cv-34和Cv-35这25株诱变株的生长速度大于出发菌株。
对初筛试验的实验数据作极差分析，结果见表2：
表2 Cv-xi诱变株生长速度频数分布表
组限 组中值（xc） 频数（f）
(A)1.62～1.35 1.485 8
(B)1.34～1.08 1.215 3
(C)1.07～0.81 0.945 6
(D)0.80～0.54 0.675 2
(E)0.53～0.27 0.405 4
(F)0.26～0.00 0.135 2
极差分析表明：A组中8个诱变菌株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33与Cv出发菌株的菌丝体生长速度差值最大，菌丝体生长速度明显高于出发菌株。
2.1.3 Cv诱变菌株的复筛
将生长速度最快的诱变菌株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33，分别接种于发酵培养基Ⅰ中振荡培养6d后，比较它们的菌丝体生长量和胞内多糖产量。结果见表3。
表3 Cv诱变株的复筛试验
菌株 Strains 菌丝体干重 （mg/100ml） 胞内多糖 （mg/100ml） 得率 （%）
出发菌株 1176.50 89.00 7.56
2 427.00 172.25 40.34
5 667.50 163.25 24.46
10 746.00 63.50 8.51
13 1210.00 108.25 8.95
15 1046.00 54.25 5.20
16 972.50 55.00 5.66
22 1228.00 67.25 5.48
33 1088.50 107.50 9.88
由表3可知：8个诱变株经深层培养后，诱变株Cv-13、Cv-22比出发菌株的菌丝体生长量高。从胞内多糖的产量来看，诱变株Cv-2、Cv-5、Cv-13、Cv-33与出发菌株相比有不同程度的提高，其中Cv-2的胞内多糖产量最高，为出发菌株的1.9倍；Cv-5的胞内多糖产量位于第二，为出发菌株的1.8倍。从胞内多糖的得率来看，诱变株Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-33得率与出发菌株相比有不同程度的提高，其中Cv-2、Cv-5得率明显高于出发菌株。综合考虑，选取Cv-5作为深层发酵的优选菌株。
2.2 诱变株Cv-5的营养条件试验
2.2.1 碳源对菌丝体生长量和胞内多糖产量的影响
碳源是微生物培养基的一个重要成分，它主要用于合成细胞碳素物质，为细胞的生命活动提供能量[11]。对Cv-5优选菌株进行深层发酵培养，研究不同碳源对菌丝体生长和胞内多糖产量的影响。本实验选用柠檬酸、甘油、葡萄糖、蔗糖 、麦芽糖、糊精、淀粉、玉米粉8种不同的碳源进行发酵培养，比较这几种碳源对菌丝体生长量和胞内多糖产量的影响。结果见表4。
表4 几种碳源对菌丝体生长和胞内多糖产量的影响
碳源 菌丝体干重 （mg/100ml） 胞内多糖 （mg/100ml） 得率 （%）
柠檬酸 70.50 8.50 12.06
甘油 803.50 30.33 3.77
葡萄糖 792.50 18.83 2.38
蔗糖 811.00 32.33 3.99
麦芽糖 816.50 22.83 2.80
糊精 805.50 26.67 3.31
淀粉 818.00 40.17 4.91
玉米粉 1081.00 33.17 3.07
由表4可知：供试菌株在这几种碳源中均能生长，并能合成胞内多糖，但不同碳源对菌丝体生长及胞内多糖产量的影响有差异。当碳源为玉米粉时，诱变株Cv-5的菌丝体生长产量最多，为1081.00mg/100ml，其次是淀粉，为818.00mg/100ml。而最利于胞内多糖合成的碳源为淀粉，诱变株Cv-5的胞内多糖产量可达40.17mg/100ml，其次是玉米粉，为33.17 mg/100ml。另外，当碳源为柠檬酸时，胞内多糖得率最高，为12.06 %，与位于第二的4.91 %(淀粉为碳源)相差较大，但碳源为柠檬酸时，菌丝体生长产量最少，可见柠檬酸不利于诱变株Cv-5的生长，而且作为发酵碳源成本较高。从成本、菌丝体生长量、胞内多糖产量等因素综合考虑，诱变株Cv-5最适宜碳源为玉米粉、淀粉。
2.2.2 氮源对菌丝生长与胞内多糖产量的影响
氮源主要用于构成菌丝体细胞物质和含氮的目的产物[11]。本实验选用有机氮源蛋白胨、牛肉浸膏、酵母粉、麸皮、黄豆饼粉和硫酸铵、 硝酸钾等无机氮源进行深层发酵试验，研究不同氮源对菌丝体生长和胞内多糖产量的影响。结果见表5。
表5 几种氮源对菌株的菌丝体生长与胞内多糖产量的影响
氮源 菌丝体干重 （mg/100ml） 胞内多糖 （mg/100ml） 得率 （%）
蛋白胨 442.50 14.00 3.16
牛肉浸膏 473.00 10.33 2.18
酵母粉 415.00 9.00 2.17
麸皮 335.00 18.67 5.57
黄豆饼粉 441.50 16.33 3.70
硫酸铵 237.50 3.33 1.40
硝酸钾 714.00 31.67 4.44
由表5可知：当氮源为硝酸钾时，诱变株CV-5的菌丝体生长产量最多，为714.00mg/100ml，其次是牛肉浸膏，为473.00mg/100ml。而最适宜胞内多糖合成的氮源是硝酸钾、麸皮和黄豆饼粉，产量分别31.67mg/100ml 、18.67mg/100ml和16.33mg/100ml。另外，当氮源为麸皮、硝酸钾和黄豆饼粉时，胞内多糖得率分别是5.57%、4.44%和3.70%。从菌丝体生长量、胞内多糖产量两因素考虑，认为硝酸钾、麸皮、黄豆饼粉是有利于诱变株CV-5菌丝体生长和胞内产多糖的氮源；从成本、菌丝体生长量、胞内多糖产量等因素综合考虑，认为硝酸钾、黄豆饼粉是有利于诱变株CV-5菌丝体生长和胞内产多糖的氮源。
2.2.3 碳氮源的正交试验
单因子实验结果表明，碳、氮源中玉米粉、淀粉、黄豆饼粉、硝酸钾对诱变株Cv-5的菌丝体生长量及胞内多糖产量影响最大。为考虑这些因子协同作用，并确定其最佳组成及配比，选用玉米粉、淀粉、黄豆饼粉、硝酸钾四因子，各取3个水平L9（34）进行正交试验。实验设计及分析结果见表6、表7。
表6 正交实验因子水平表
因子 玉米粉 淀粉 黄豆饼粉 硝酸钾
水平 A（%） B（%） C（%） D（%）
1 1.5 0.0 0.5 0.0
2 2.0 1.0 1.0 0.3
3 2.5 1.5 1.5 0.5
表7 正交实验结果的极差分析
因素 实验号 A B C D 菌丝体干重 (mg/100ml) 胞内多糖干重 （mg/100ml）
1 1（1.5） 1（0.0） 1（0.5） 1（0.0） 759.0000 42.1667
2 1（1.5） 2（1.0） 2（1.0） 2（0.3） 612.0000 67.6667
3 1（1.5） 3（1.5） 3（1.5） 3（0.5） 902.5000 45.5000
4 2（2.0） 1（0.0） 2（1.0） 3（0.5） 744.5000 76.0000
5 2（2.0） 2（1.0） 3（1.5） 1（0.0） 1077.5000 65.0000
6 2（2.0） 3（1.5） 1（0.5） 2（0.3） 607.5000 76.6667
7 3（2.5） 1（0.0） 3（1.5） 2（0.3） 1183.0000 99.3333
8 3（2.5） 2（1.0） 1（0.5） 3（0.5） 603.0000 64.8333
9 3（2.5） 3（1.5） 2（1.0） 1（0.0） 1081.0000 90.0000
K1 菌 K2 体 K3 干 k1 重 k2 k3 R 2273.5000 2429.5000 2867.0000 757.8333 809.8333 955.6667 197.8334 2686.5000 2292.5000 2591.0000 895.5000 764.1667 863.6667 131.3333 1969.5000 2437.5000 3163.0000 656.5000 812.5000 1054.3333 397.8333 2917.5000 2402.5000 2250.0000 972.5000 800.8333 750.0000 222.5000
K1 胞 K2 内 K3 多 k1 糖 k2 干 k3 重 R 155.3334 217.6667 254.1666 51.7778 72.5556 84.7222 32.9444 217.5000 197.5000 212.1667 72.5000 65.8333 70.7222 6.6667 183.6667 233.6667 209.8333 61.2222 77.8889 69.9444 16.6667 197.1667 243.6667 186.3333 65.7222 81.2222 62.1111 19.1111
由表7可知：各试验因素对菌丝生长的影响程度为 C＞D＞A＞B，即黄豆饼粉是影响菌丝生长的主要因素（R=397.8333），硝酸钾、玉米粉是次要因素（R=222.5000、197.8334）,淀粉对菌丝生长的影响最小（R=131.3333）。理论上最利于菌丝体生长的培养基组合为 A3 B1 C3 D1 ，即玉米粉2.5% 、黄豆饼粉1.5% 。各试验因素对胞内多糖的影响程度为 A＞D＞C＞B , 即玉米粉是影响胞内多糖合成的主要因素（R=32.9444），硝酸钾、黄豆饼粉是次要因素（R=19.1111、16.6667）,淀粉对胞内多糖的影响最小（R=6.6667）。理论上最适宜胞内多糖合成的培养基组成为 A3 B1 C2 D2 ，即玉米粉2.5% 、黄豆饼粉1 .0% 、硝酸钾0.3% 。
对正交试验的实验数据作多元线性回归分析，结果如下：
a、对菌丝体生物量的回归分析：
回归方程式: Y = 201 .15 + 197.83 A - 36.95 B + 397.83 C - 455.04 D
相关系数 R = 0.958 * （ R 0.05 = 0.930 ， R 0.01 = 0.970 ）
说明各因素与菌丝体生物量之间存在着显著的相关。
标准差 Se = 92.66
F值 11.05
样本数 N = 9
表8 方差分析表
变异来源 df ss S2 F F0.05 F0.01
回归 4 379575.37 94893.84 11.05* 6.388 15.98
剩余 4 34346.52 8586.63
总的 8 413921.89
F检验显著,说明回归方程揭示的规律性强。
b、对胞内多糖产量的回归分析：
回归方程式： Y = - 2.581 + 32.94 A - 1.97 B + 8.72 C - 2.57 D
相关系数 R = 0.796
标准差 Se =15.92
F值 1.73
样本数 N = 9
经方差分析，差异不显著。
2.2.4 无机盐对菌丝体生长量和胞内多糖产量的影响
微生物在生长繁殖和合成目的产物的过程中，需要某些无机盐和微量元素以作为其生理活性物质的组成或生理活性物质合成时的调节物。这些物质一般在低浓度时对微生物生长和目的产物合成有促进作用，在高浓度时常表现出明显的抑制作用[11]。因此，培养基成分中的无机盐浓度也是影响微生物生理活性的重要因子。采用均匀试验的方法，比较MgSO4 · 7H20和KH2PO4 这两种无机盐及不同浓度对菌丝体生长量和胞内多糖产量的影响。设计方案及结果见表9、表10。
表9 均匀试验因子水平表
水平因子 1 2 3 4 5 6 7
A MgSO4 · 7H20(%) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3
B KH2PO4 (%) 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3
表10 均匀试验的设计和结果
试验次数 A B 菌丝干重 （mg/100ml） 胞内多糖干重 （mg/100ml）
1 1(0.1) 3(0.5) 573.0 61.8333
2 2(0.3) 6(1.1) 893.0 99.0000
3 3(0.5) 2(0.3) 718.5 49.1667
4 4(0.7) 5(0.9) 936.5 57.5000
5 5(0.9) 1(0.1) 855.5 82.0000
6 6(1.1) 4(0.7) 715.0 61.6667
7 7(1.3) 7(1.3) 1225.0 92.0000
对均匀试验的实验数据作多元线性回归分析，结果如下：
a、 对菌丝体生物量的回归分析：
回归方程式： Y = 400.46 + 310.18 A + 325.18 B
相关系数 R = 0.929 * （ R0.05 = 0.811 ， R0.01 = 0.949 ）
说明各因素与菌丝体生物量之间存在着显著的相关。
标准差 Se = 94.72
F值 6.41
样本数 N = 7
表11 方差分析表
变异来源 df ss S2 F F0.05 F0.01
回归 2 226187.09 113093.55 12.61* 6.944 18.00
剩余 4 35885.34 8971.34
总的 6 262072.43
F检验显著,说明回归方程揭示的规律性强。
分析回归方程式，可以看出各项系数均为正值。所以，在考察的配比范围内，A、B取值越大，菌丝生长情况越好。故优化结果，将A =1.3 , B =1.3 代入回归方程中得理论上菌丝体生物量的最大值及其波动范围。
= 1226.43 mg/100ml
Y = U α * Se ( 查表得： U 0.05 = 1.645 )
Y = 1226.43 155.81 mg/100ml
所以，优化结果的菌丝干重的范围是：1070.62 ～ 1382.24 mg/100ml。
(查表得： U 0.05 = 1.645)
b、对胞内多糖干重回归分析：
回归方程式： Y = 191.84 + 42.20 A - 6.06 B
相关系数 R = 0.471 * （ R0.05 = 0.811 ， R0.01 = 0.949 ）
说明各因素与菌丝体生物量之间存在着显著的相关。
标准差 Se = 42.21
F值 0.57
样本数 N = 7
经方差分析，差异不显著。
小结：
1、出发菌株Cv经紫外诱变处理后，选取紫外照射剂量为1′的诱变菌株在PDA斜面上培养，筛选出8个优质菌株。分别是Cv-2、Cv-5、Cv-10、Cv-13、Cv-15、Cv-16、Cv-22、Cv-33。从菌丝体生长量来看，诱变株Cv-22最高，达1228.00mg/100ml ，其次是诱变株Cv-13，达1210.00mg/100ml。从胞内多糖的产量来看，诱变株Cv-2最高，为172.25mg/100ml，其次是诱变株Cv-5，为163.25mg/100ml。本次紫外诱变育种挑选出4个优质菌种，为Cv-2、Cv-5、Cv-13、Cv-33。
2、选取诱变株Cv-5作为进一步深层发酵的优质菌株，该菌株在PDA斜面上生长速度快，达7.86 mm/d，长势旺盛。在发酵培养基中菌丝体生长量和胞内多糖产量较出发菌株有明显的提高（菌丝体生长量为667.50mg/100ml，胞内多糖产量为163.25mg/100ml，得率为24.46%）。
3、对优质菌株Cv-5的营养条件进行初步的研究。碳氮源试验、正交试验、均匀试验结果表明，最有利于菌丝体生长的培养基的最佳配比为：玉米粉2.5% 、黄豆饼粉1.0% 、硝酸钾0.3% 、MgSO4 · 7H20 1.3%、KH2PO4 1.3%，菌丝体生长量达1225.0mg/100ml。最适宜胞内多糖合成的培养基的最佳配比为：玉米粉2.5% 、黄豆饼粉1 .0% 、硝酸钾0.3% 、MgSO4·7H20 0.3%、KH2PO4 1.1%，胞内多糖产量可达99.0mg/100ml。
参考文献： 略
