微生物絮凝剂是利用生物技术,通过微生物发酵、分离提取而得到的一种新型、高效、安全且能自然降解的新型水处理剂,其主要有效絮凝成分为糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素和DNA等大分子物质.它不仅可以提高被絮凝物质的沉降性能,而且对环境无二次污染,使用方便、安全、应用范围广.微生物絮凝剂产生菌主要包括来源于土壤、活性污泥中的霉菌、细菌、放线菌和酵母菌等.由于能产生絮凝剂的微生物种类多,生长快易于实现工业化,同时微生物絮凝剂可以克服无机高分子和合成有机高分子絮凝剂本身固有的缺陷,既可生物降解,又安全可靠,同时易于固液分离,形成沉淀物少,最终实现无污染排放,因此微生物絮凝剂的研究正越来越受到关注[1~4]本文研究主要是从活性污泥和稻田土壤中分离和筛选絮凝剂产生菌,并对其产絮凝剂的最佳培养条件进行初步探讨.
1 材料与方法
1.1 菌种来源及培养基
菌种来源:沈阳市北部污水处理厂曝气池活性污泥;沈阳市郊稻田土壤.
分离培养基(牛肉膏蛋白胨培养基):牛肉膏3.0g,蛋白胨10.0g,琼脂20g,NaCl5.0g,自来水1000mL,pH7.0~7.2.
发酵培养基:①牛肉膏蛋白胨培养基:牛肉膏3.0g、蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、自来水1000mL、pH7.0.②YA培养基:酵母膏20.0g、KH2PO41.0g、MgSO4#7H2O0.5g、自来水1000mL、pH7.5.③GC培养基:葡萄糖20.0g、KH2PO42.0g、K2HPO45.0g、(NH4)2SO40.2g、NaCl0.1g、尿素0.5g、酵母膏0.5g、自来水1000mL、pH7.5~8.5.
1.2 筛选方法
1.2.1 目的菌株的分离筛选
采用稀释涂布、划线的方法在平板上分离细菌单菌株,接种过的平板倒置于35℃生化培养箱中培养72h,观察分离出的单菌落长势及菌落特征,以长势好、菌落光滑并有粘性为初筛指标.将初筛目的菌株用发酵培养基①进行液体培养,培养条件为:装液量100mL(250mL三角瓶),水浴温度35℃,摇床转数120r/min,培养时间72h,发酵液以3000r/min离心20min,测定上清液絮凝活性.将复筛得到絮凝活性较高的目的菌株用斜面进行保存.
1.2.2 絮凝活性的测定方法
在200mL烧杯中加入98mL高岭土悬浊液(4g/L),1mL质量分数为1%的CaCl2和2mL发酵液的上清液,调节pH至7,置于六联搅拌器搅拌5min,静置5min,吸取一定深度的液层于722型分光光度计550nm处测定吸光度,以不加发酵液的样品为对照,以絮凝率定量表示絮凝活性.
絮凝率=(A-B)/Ax100%.
式中:A为未絮凝处理的对照上清液550nm处的吸光度,B为絮凝处理后的上清液550nm处的吸光度.
1.3 絮凝剂产生菌菌种鉴定[5]
参照一般细菌常用鉴定方法,对目的菌株进行生理和生化特征测定.
1.4 产絮凝剂菌种生长曲线的测定
500mL三角烧瓶内装200mL牛肉膏蛋白胨液体培养基,接入适量BX-1种子液,置于120r/min摇床上,35℃振荡培养,每隔6h取样分别进行絮凝活性、生物量(以培养液660nm处光密度值表示)的测定.
1.5 培养条件的优化
本次实验主要考察培养基成分组成、培养时间、初始pH值、通气量等因素对目的菌产絮凝剂的影响.除特殊说明外,发酵培养基均为YA培养基,装液量100mL(250mL三角瓶),水浴温度35℃,摇床转数120r/min,培养时间72h,发酵液以3000r/min离心20min,测定上清液絮凝活性,菌体用蒸馏水洗涤3次,在80℃下烘干称重得菌体干重.
2 结果与讨论
2.1 目的菌株的筛选及鉴定结果
经平板涂布和划线分离培养,从活性污泥、稻田土壤中分离到28株细菌,初筛得到生长较快、菌落较光滑透明、湿润并有粘性的细菌9株.将9株初筛菌株分别进行发酵培养,测定其絮凝活性,其中5株菌有絮凝活性,结果见表1.
由表1可知,从活性污泥中分离筛选到一株产絮凝剂细菌BX-1,该细菌的发酵液对高岭土悬浮液的絮凝率达77.5%.该菌的菌落为淡黄色、半透明、圆形、有光泽、湿润、具有粘性.生理、生化特性测定表明,该菌为革兰氏阳性杆菌,产端生椭圆形芽孢,不运动,接触酶、明胶液化、甲基红实验阳性,氧化酶、产H2S实验阴性,能利用葡萄糖产酸.参照《常见细菌系统鉴定手册》,初步鉴定BX-1为芽孢杆菌属(Bacillussp).
2.2 发酵液中絮凝成分的分布
发酵液离心,菌体用蒸馏水洗涤后用与上清液等体积的蒸馏水制成菌悬液,分别测定发酵液、上清液及菌悬液对高岭土溶液的絮凝率.实验结果表明具有絮凝活性的成分存在于上清液中,絮凝率达85%以上,菌体无絮凝活性.这说明絮凝活性成分是菌体分泌到胞外的代谢产物.
2.3 培养时间对BX-1的生长及产絮凝剂的影响
培养时间对BX-1的生长及絮凝剂分泌的影响见图1.
从图1结果进一步表明:培养液的絮凝活性成分是菌体进入生长稳定期开始合成的代谢产物,在菌体生长稳定期末絮凝活性最高.
2.4 培养基成分对BX-1产絮凝剂的影响
2.4.1 不同种类培养基对絮凝剂生产的影响
BX-1在3种培养基中生长及产絮凝剂的结果见表2.
从表2可知,BX-1在牛肉膏蛋白胨和YA培养基中的生长及产絮凝剂活性较高,表明BX-1的生长及产絮凝剂需要丰富的有机氮源,而高碳低氮的GC培养基不利于BX-1的生长及絮凝剂的分泌.
2.4.2 培养基中碳、氮源对BX-1产絮凝剂的影响
以YA培养基为基础,改变氮源的种类和投加量,同时每100mL培养基外加1g不同碳源,实验结果见表3.
由表3可以看出在YA培养基中不同碳、氮源对BX-1的生长和产絮凝剂的影响存在较大差异.当有机氮加入量在1g(100mL培养基),不加其它碳源时,生物量虽然少,但絮凝活性可达70%以上.加入1g麦芽糖既有利于菌体的生长又有利于絮凝剂的分泌,絮凝活性高达95%.当有机氮加入量为2g(100mL培养基)时,BX-1的生物量有所增加,但絮凝剂的分泌受到抑制,发酵液没有絮凝活性.进一步表明该菌所产絮凝剂为细胞代谢产物,絮凝剂的分泌与生物量之间无正相关关系,而培养基组成成分及加入量对代谢产物的合成确有明显的影响,这与文献报道有所不同[1,6~8].
2.5 培养基初始pH值对BX-1产絮凝剂的影响
图2为BX-1在不同初始pH值YA培养基(每100mL培养基含麦芽糖、蛋白胨各1g)中产絮凝剂絮凝活性的变化.图2表明,培养基的初始pH值可显著影响BX-1合成和分泌絮凝剂.在pH6.0~7.0时絮凝剂分泌量大,絮凝率在80%以上;在pH大于7.0时絮凝率呈下降趋势,说明偏酸性环境有利于此菌分泌絮凝剂.
2.6 通气量对BX-1产絮凝剂的影响
YA培养基(每100mL培养基含麦芽糖、蛋白胨各1g),pH6~7,改变装液量了解溶解氧对BX-1产絮凝剂的影响,其培养液絮凝率变化见图3.
由图3可知,装液量在80~90mL时的絮凝率最高,大于100mL后絮凝率明显下降,证明溶解氧对BX-1产絮凝剂有一定影响,该菌是好氧菌.
3 结 论
(1)从活性污泥、稻田土壤中分离筛选到5株微生物絮凝剂产生菌,经过复筛得到一株高效絮凝剂产生菌BX-1,初步鉴定为芽孢杆菌属(Bacillussp).
(2)BX-1产絮凝剂的适宜培养基及培养条件为每100mL培养基:麦芽糖1g,蛋白胨1g,KH2PO40.1g、MgSO4#7H2O0.05g,pH值6.0~7.0,温度为35℃,装液量80~90mL(250mL三角瓶),摇床(120r/min)培养60~72h;所产絮凝剂对高岭土悬液的絮凝率达95.4%.
(3)培养基种类对BX-1产絮凝剂有较大影响.在YA培养基中氮源的种类及投加量对菌体生长及絮凝剂的分泌有不同的影响.当氮源加入量在1g(每100mL培养基)时菌体产絮凝剂活性最好,加入量在2g(每100mL培养基)时菌体生物量增加,但发酵液絮凝活性很低,甚至无絮凝活性.絮凝剂的分泌与菌体生物量之间无正相关关系,而受培养基成分及碳、氮源投加量的影响比较明显.
参考文献:
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