含油泥砂是油田开发过程中产生的重要污染源之一,油泥砂含有大量原油,对周围的大气、水质和土壤会造成严重的污染。原油中的多环芳烃被认为是一种致癌、致诱变物质,会严重影响人类健康。因此,需要研究含油泥砂无害化处理技术,寻找经济可行的处理方法。
含油泥砂的处理方法主要有物理、化学和生物等方法。生物技术发展迅速,应用领域越来越广,目前利用微生物治理环境有机污染的研究受到世界各国的普遍关注,相关研究十分活跃,并取得了可观的成就。生物处理法利用微生物将泥砂中的原油污染物降解为ＣＯ2和Ｈ2Ｏ,实现无害化处理。微生物具有分布广、数量多、代谢类型多样和适应突变能力强的特点,在任何存在污染物的地方都会出现相应的可降解污染物的微生物,利用经过驯化、筛选、诱变或基因重组等获得的高效降解菌种来处理污染物,与物理化学方法相比,具有安全性好,无二次污染,易于管理等优点,因此日益受到国内外环保界的重视。
1 仪器与材料
(1)主要实验仪器
Ｏｌｙｍｐｕｓ相差显微镜;Ｂｅｃｋｍａｎｇｓ 15冷冻离心机;ＣＳＣ ＤｕＮｏｕｙ70545表界面张力仪;ＬｏｖｉｂｏｎｄＢＯＤ测试仪。(2)无机培养基(ｇ/Ｌ)
ＮａＮＯ3 0.5;(ＮＨ4)2ＳＯ4 0.5;ＭｇＳＯ4 0.02;ＣａＣｌ2 0.02;ＫＨ2ＰＯ4 1.0;Ｎａ2ＨＰＯ4 1.0。
(3)油泥砂培养基(ｇ/Ｌ) 无机培养基中加入50ｇ/Ｌ油泥砂。
(4)油泥砂 取自孤东油田联合站,为储油罐罐底清出的油泥砂,混合均匀、除杂后供实验用。油泥砂含油量用石油醚淋浸萃取法测试。
2 实验结果与讨论
2.1 筛选细菌的性能
2.1.1 菌种筛选从孤东油田联合站周围原油污染的土壤中,经富集、筛选、分离、驯化,优选出3株性能较好的菌种。3株细菌接入烃类氧化菌测试瓶,35℃下培养48ｈ后,瓶内溶液都由红色变为浅黄色,表明3株细菌都是烃类氧化菌,分别编号为ＧＤ-1、ＧＤ-2、ＧＤ-3。
2.1.2 细菌利用原油作碳源的生长情况
将优选的3株细菌分别接种于油泥砂培养基中,在35℃通气条件下培养48ｈ,用ＭＰＮ稀释法测试发酵液中的细菌数,均在6.0×107个/ｍＬ以上。在显微镜下观察,细菌活性好,说明3株细菌都能利用油泥砂中的原油作为碳源快速生长、代谢和繁殖。快速增殖及高代谢活性的微生物可使油泥砂中的原油快速、大量降解,最终实现石油烃类污染物的处理。
2.1.3 菌种ＢＯＤ5值测试
无机培养基和油泥砂分别灭菌,定量的无机培养基和油泥砂在无菌条件下加入ＢＯＤ测试瓶中,以1%接种量接入筛选的细菌,对照样中油泥砂不灭菌且不接种细菌。在20℃环境下测试,所筛选细菌的ＢＯＤ5值,ＧＤ-1为165ｍｇ/Ｌ,ＧＤ-2为145ｍｇ/Ｌ,ＧＤ-3为175ｍｇ/Ｌ,均明显高于对照样(100ｍｇ/Ｌ)。说明菌种经室内驯化后,利用原油进行生长代谢的能力明显增强。
2.1.4 发酵液表面活性物质的分析筛选菌株用油泥砂培养基培养48ｈ后,发酵液混浊,颜色变深,可看到含有从油泥砂表面剥离下来并被乳化的小油珠。将发酵液用滤纸过滤,测试滤液表面张力,观察滤液颜色。结果见表1。这一实验结果表明,3组发酵液滤液的表面张力降低率均在45%以上,说明3株细菌都能利用油泥砂中的原油生长代谢产生表面活性物质。滤液颜色由无色变为褐色,估计是细菌代谢产生的表面活物质使原油中某些组分溶解所致。
取滤液在8000ｒ/ｍｉｎ下离心20ｍｉｎ,离心管内液体表面有一层浮油,上清液颜色变浅,证实所筛选细菌利用油泥砂中原油代谢产生的表面活性物质确实可以溶解部分原油组分。按文献[1]介绍的方法,
取部分上清液用浓盐酸调ｐＨ至2 0,在4 0℃下放置一段时间后,ＧＤ-1、ＧＤ-2两株细菌的上清液产生絮状沉淀,确定为一种脂肽类表面活性剂。另按文献[2]介绍的方法,将菌株ＧＤ-3的上清液冷却至4 0℃后,搅拌下加入硫酸铵至30%的饱和度,放置一段时间后倾去上层液体,将沉淀物再悬浮于30%的硫酸铵溶液中,离心后合并上清液,再加入硫酸铵至40%的饱和度,10000ｒ/ｍｉｎ下离心15ｍｉｎ,将沉淀物溶于100ｍＬ水中,用乙醚抽提2次,将水相用蒸馏水透析数次后冷冻干燥,所得物质经紫外、红外及水解后还原糖测定等方法鉴定,确定为脂多糖类表面活性物质。细菌利用原油代谢产生生物表面活性物质,一方面可以改变油泥砂表面的润湿性,使得油泥砂表面的原油容易被剥离下来,另一方面可以使烃类乳化,油水接触面增大,烃类被动扩散进入细胞内而被降解。
2.2 筛选菌种处理油泥砂的效果
不同的石油降解菌对于石油中不同的烃类具有不同的降解能力。据报道,多数石油降解菌只能利用一种或几种烃,具有协同效应的混合菌种对油泥砂的处理效果要明显好于单一菌种[3,4],另外,在石油污染环境中存在着自然的微生物生态系统,几种微生物竞争或合作维持生态系统的平衡[5]。因此,在进行油泥砂处理的实验中直接使用3株细菌的混合液,将油泥砂与水按1∶5的比例混合,补加适量(ＮＨ4)2ＳＯ4、ＫＨ2ＰＯ4作为氮源和磷源,其补加量使氮和磷的质量浓度分别控制在85ｍｇ/Ｌ和15ｍｇ/Ｌ,按5%的接种量接入混合菌种,在35℃通气条件下对油泥砂进行搅拌处理,定期取油泥砂测含油量、取液体样用显微镜检测细菌数。实验结果见图1。
图1 含油量(曲线1)、细菌数(曲线2)随时间的变化(35℃,通气)
由图可以看出,所筛选的细菌对含油泥砂有比较好的处理效果,开始时含油量下降比较快,10天后含油量下降有所减缓。细菌数在4天时达到最大,10天后有所下降,可能是处理时间延长消耗了大部分的氮源和磷源,而氮源和磷源的缺乏抑制了细菌的生长繁殖,影响了油泥砂的处理效果。尽管如此,所筛选的混合细菌对含油泥砂的除油效果仍相当好,含油泥砂初始含油量为12.3%,处理30ｄ后下降到2 9%。将生物处理前后的含油泥砂通过放大镜进行拍照,可以看出经处理后油砂表面附着的油量明显减少。
2.3 化学表面活性剂对油泥砂处理效果的影响
粘附在泥砂表面的原油不能溶于水,很难被细菌利用。加入少量化学表面活性剂可以改善油的水溶性,使得原油比较容易被细菌降解。在加入氮源、磷源的油泥砂和水的混合液中加入0.01%化学表面活性剂,在35℃通气条件下对油泥砂进行搅拌处理。结果见图2。由图2可以看出,加入0.01%的化学表面活性剂后,细菌数在3天时达到最高,即细菌的生长速度加快,但细菌数和含油量变化趋势及最终达到的水平基本上不变。生物表面活性剂可以增强疏水的烃类污染物的生物可利用性和生物降解性,刺激亲油
图2 加入化学表面活性剂后含油量(曲线1)、细菌数(曲线2)随时间的变化
底物中细胞的增长[6]。加入少量化学表面活性剂可以加快初期细菌的生长,但对最终处理效果没有根本影响。
