摘要:乳糖酶是存在于哺乳动物小肠黏膜微绒毛膜表面上的一种双糖酶。乳糖酶缺乏(LD)是个世界性的问题,影响了全世界近2 /3的人口,亚洲的患病率高达95% ～100%。LD会造成乳糖吸收不良,甚至出现一系列乳糖不耐受的症状,对人类的健康造成很大的威胁。现就LD的分子生物学研究进展综述如下。
乳糖存在于哺乳动物的乳汁中,为无色晶体,在人乳中约含7%。乳糖被乳糖酶水解为半乳糖及葡萄糖后被机体吸收。乳糖酶在小肠黏膜双糖酶中成熟最晚,含量最低,最易受损,恢复也最慢,与人类健康的关系密切。当小肠黏膜乳糖酶缺乏( lactase deficiency,LD)或酶活性受到抑制,未被吸收的乳糖滞留在肠道中,被肠道细菌发酵分解成乳酸和CO2等气体,并使肠腔内渗透压增高,进而引起肠胀气、肠痉挛、甚至腹泻,使大量营养素尤其是钙吸收不良,称为乳糖不耐受( lactose intolerance,L I) 。当LD只引起乳糖吸收障碍而无临床症状时,称为乳糖吸收不良。LD可分为3类:原发性LD、继发性LD 和先天性LD。原发性LD 也叫成人型乳糖酶缺乏( adult-type hypolactasia,ATH) 、乳糖酶非持续活性或遗传性的LD。妊娠8～34周,胎儿的乳糖酶已经形成并且活性逐渐上升,妊娠晚期发展更为迅速,婴儿期出现峰值,多数人乳糖酶活性持续至2～15岁,随年龄增长逐渐降至成人缺乏乳糖酶的水平。ATH 在不同的种族中患病率不同, 北欧2% ～ 15%、中欧9%～23%、黑种人和北欧犹太人为60% ～80%、美洲印第安人80% ～100%、美国白种人6% ～22%、西班牙50% ～80%、印度北方20%～30%、印度南方60%～70%、亚洲95%～100%[ 1 ]。中国3～5岁、7～8岁和11～13岁儿童中, LD的发生率分别为38. 5%、87. 6% 和87. 8% ,L I发生率分别为12. 2%、32. 2%和29. 0%[ 2 ] 。继发性LD可发生于所有累及小肠黏膜的疾病及某些全身性疾病,如乳糜泻、克罗恩病、Whipp le病、兰氏贾第鞭毛虫感染、感染性腹泻、短肠综合征、β2胰蛋白缺乏症、免疫球蛋白缺乏症、免疫缺陷、重度营养不良、腹部放射线照射、过量饮酒等,且可同时存在麦芽糖酶和蔗糖酶缺乏。上述疾病若能恢复,双糖酶可能恢复至接近正常。某些病例继发性LD可能持续存在。先天性LD指出生时机体乳糖酶几乎完全缺乏,此型极少见,是一种常染色体隐性遗传的疾病。小肠刷状缘乳糖酶活性自出生就低下或缺如,新生儿哺乳后1～2 h即出现腹泻等L I症状,严重的伴有呕吐、失水、酸中毒等。
1 LD的临床表现
因肠道乳糖酶缺乏,食物中的乳糖在小肠内不能被乳糖酶完全消化吸收而滞留于肠腔内,使肠内容物的渗透压增高,体积增加,肠排空加快,导致腹胀、肠鸣、肠绞痛、腹泻等肠道症状。同时,乳糖在小肠下段、结肠中细菌作用下发酵生成甲酸、乙醛、吲哚、短链脂肪酸等潜在的毒性成分和氢气、CO2 和甲烷等气体[ 3 ]。短链脂肪酸可使渗透作用加强,促进腹泻发生。半乳糖和乳糖本身被肠道直接吸收进入血液也是有毒性的。还有很多L I患者在停止摄入乳糖后腹泻会持续数日,推测与霍乱肠毒素的作用相似,乳糖还可能通过影响信号转导引起腹泻。L I患者也可出现恶心、呕吐,部分患者肠道运动减弱出现便秘而不是腹泻。此外,部分患者还会出现全身的症状,比如头痛、注意力不集中、记忆力下降、疲乏无力、肌肉和关节疼痛、心律不齐、口腔溃疡、尿频、咽喉痛、各种过敏反应(如湿疹、鼻炎、鼻窦炎、哮喘、瘙痒症) [ 4 ]。然而这些症状间断出现,容易被忽略。LD人群中仅有20%左右的人存在L I症状,且症状个体差异很大,与小肠黏膜残余的乳糖酶活性、进入肠道的乳糖量、胃排空速率、肠的乳糖转运时间、肠道细菌发酵乳糖的能力以及大肠对肠腔渗透压改变后的代偿作用有关。
乳糖吸收不良会影响营养的吸收,在婴幼儿及老年人尤其明显。在婴幼儿中会引起营养不良,影响生长发育,在老年人会引起骨质疏松症[ 5 ]。此外,Von Tirp itz等[ 6 ]提出ATH与克罗恩病相关。
2 乳糖酶的分子生物学的研究进展
2. 1 乳糖酶的结构和生物合成过程 乳糖酶又称β2半乳糖苷酶,对乳糖真正起水解作用的为乳糖酶根皮苷水解酶。根皮苷水解酶具有两种酶的活性: ①乳糖酶,只存在于哺乳动物体内,将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖; ②根皮苷水解酶(糖基-N2神经酰胺2葡萄糖水解酶) ,只存在于脊椎动物体内,作用于根皮苷和β2糖基神经酰胺。糖基神经酰胺存在于大多数脊椎动物的食物中(包括牛奶) ,是根皮苷水解酶的天然底物。
乳糖酶为一条多肽链,上面有乳糖酶和根皮苷水解酶的作用位点,并通过羧基末端的一段疏水氨基酸序列连接在肠黏膜微绒毛膜表面。乳糖酶基因位于2 号染色体长臂(2q21) ,由50 000个碱基对组成,包含有17个外显子。启动子位于乳糖酶基因前端,由1 000 个碱基对组成。乳糖酶mRNA由6 274个碱基对组成,前乳糖酶原(初级翻译产物)由位于氨基末端的信号肽域(19个氨基酸) 、前导肽域( 849个氨基酸) 、胞外域(1 014个氨基酸) 、疏水的跨膜锚定区(19个氨基酸) 、羧基末段的胞内段(26个氨基酸)组成。前乳糖酶原在信号肽的引导下进内质网中,信导肽被切除,被N2糖基化,形成二聚体,并在分子伴侣的帮助下正确折叠形成乳糖酶原。乳糖酶原包含4个内部重复序列,其中前导肽域包含重复序列Ⅰ～Ⅱ,胞内段包含重复序列Ⅲ～Ⅳ。重复序列Ⅲ和重复序列Ⅳ分别具有根皮苷水解酶和LCT的活性。乳糖酶原进入高尔基体后被O2糖基化,然后经历细胞内和肠腔的两次裂解后形成成熟的乳糖酶。
2. 2 调控乳糖酶基因表达的元件 乳糖酶上游启动子元件,是位于转录起始位点上游,由150个碱基对组成的片段,这个序列在鼠、兔、猪和人中都是保守的。乳糖酶上游启动子元件包含了3 个顺式作用元件(CE1a, CE2c and GATA-site) [ 7 ]。尾侧型同源转录因子2 (Cdx-2)和同源转录因子HOXC11通过与CE1a结合启动基因的转录。Cdx-2还能与另一个位点结合,这个位点与乳糖酶基因的TATA盒重叠。然而,究竟是Cdx-2直接与这个位点结合,还是通过蛋白质相互作用,即转录起始复合体,有待于进一步的研究来阐明。HOXC11只在人胚胎时期肠道中表达,出生后即消失,表明它在肠道早期的发育中发挥特定的作用[ 8 ]。还有许多因子通过与CE1a结合抑制乳糖酶表达,这些因子可能在不表达Cdx22的细胞中发挥抑制乳糖酶转录的作用,但尚未被鉴定出,提示Cdx-2激活乳糖酶启动子可能具有组织特异性。CE2c是乳糖酶启动子中的关键元件, CE2c位点发生突变后,乳糖酶启动子的活性大大降低了[ 8 ]。体内实验表明, HNF21α在LCT表达过程中发挥重要的作用,与野生型小鼠相比,体内不表达HNF21α的小鼠,LCTmRNA降低了95%[ 9 ]。肝细胞核因子1α( hepatocyte nuclear factor 1 alpha, HNF-1α)能与乳糖酶启动子(猪、鼠、人) 中的CE2c 位点结合, 激活启动子的活性。而且,HNF-1α和Cdx-2还具有协同作用[ 10 ]。锌指转录因子(GATA因子)在体内很多组织中均有表达。GATA-1、-2、-3在造血干细胞中调节T淋巴细胞、红细胞、巨核细胞的分化特异性基因的表达; GATA-4、-5、-6在中胚层和内胚层来源的组织(如心、肝、肺、性腺和肠)中调节组织特异性基因的表达。GATA-4、-5、-6均能结合并激活人和鼠的乳糖酶启动子,其中GATA-4是调节鼠LCT表达的关键的GATA因子。GATA-4 /HNF-1α和GATA-5 /HNF-1α具有协同作用。远端调控元件增强子也参与调控乳糖酶的转录,但作用较弱。猪的乳糖酶增强子已被鉴定出来,位于乳糖酶基因上游- 850bp的位置,这个增强子区包含3个结合位点- CE2a、nt20和CE2b,其中CE2a与HNF-1α结合, nt20和CE2b的结合位点尚未鉴定出来。人和鼠的增强子元件不是保守序列。此外,在猪和人的启动子中还发现一个负性调节区CE3。在猪的研究中发现,叉头框转录因子FREAC22、23能与之结合,而在人的CE3则与肠核因子相结合[ 7 ]。增强子通过哪些因子来调节乳糖酶的转录有待于今后的研究来阐明。
2. 3 乳糖酶活性下调的机制 ATH是由于断奶后根皮苷水解酶基因表达的下调引起的,是人类普遍存在的一种肠道双糖酶缺乏症状,关于乳糖酶活性的调节因素众说纷纭。大多数研究显示,乳糖酶mRNA的水平与乳糖酶的活性和L /S比率呈正相关,说明乳糖酶活性的调节主要在转录水平[ 11 ]。但也有很多学者提出不同的观点,有学者提出乳糖酶活性的调节由顺式作用元件调节。有学者利用乳糖酶编码区中多个单核苷酸多态性来研究稳定状态的乳糖酶mRNA水平,发现不同类型的乳糖酶持续活性者乳糖酶基因是不对称表达的,说明乳糖酶等位基因是被独立调节的[ 12 ] ,因此,推测可能存在一个待检测的具有反式作用的DNA结合蛋白,其只能与一种乳糖酶等位基因结合并从而影响转录以及mRNA的稳定性。Sebastio等[ 13 ]发现,乳糖酶mRNA水平同乳糖酶活性不相关,故推测乳糖酶活性的调节在转录后水平。在乳糖酶非持续性的个体进行代谢标记研究,观察到乳糖酶蛋白合成速度减慢以及乳糖酶原合成减少。研究者还检测到乳糖酶原的生物合成与乳糖酶mRNA水平相关但与乳糖酶活性不相关。甚至,在ATH的个体中还观察到乳糖酶的嵌合调节。
2. 4 决定ATH的基因 决定ATH的基因位于2q21乳糖酶基因5′端的一段47 kb的区域。对这段47 kb区域进行序列分析,发现两个单核苷酸多态性C /T-13910 ( rs4988235) 和G/A-22018 ( rs182549) ,分别位于离乳糖酶起始密码子上游14 kb和22 kb的位置上。C/T-13910和G/A-22018分别位于微小染色体维持蛋白6基因的第13和第9内含子。
自2002 年Enattah 等[ 14 ]提出根皮苷水解酶基因上游C /T-13910和G/A-22018变异型是LD的基因标志物以来,关于这两个单核苷酸的研究很多。对数百个肠黏膜活检的分析表明,基因型C/C-13910 与乳糖酶活性( < 10 U /g蛋白)呈负相关,而基因型C/T-13910和T/T-13910 与乳糖酶活性呈正相关。C /C-13910的出现频率与已报道的芬兰人、法国人、非洲美国人、南韩人、北美高加索人ATH 的患病率是一致的[ 15 ]。然而,肠道微小染色体维持蛋白6表达产物的多少与乳糖酶活性无相关性,说明微小染色体维持蛋白6 基因对ATH的影响只限于结构上。Caco-2细胞是人结肠癌上皮细胞( the human colon carcinoma cell, Caco-2) ,具有与小肠上皮细胞相同的微绒毛结构和紧密连接,形态学及生化性质都与小肠上皮很相似,因而被大多数实验用作为研究小肠表皮细胞转运和代谢的体外模型。变异型C-13910和T-13910均能增强乳糖酶启动子的活性。然而在未分化的Caco-2细胞中研究发现,与包含C-13910的区域相比,包含T-13910的区域使乳糖酶启动子的活性增加了25% ～75%[ 16 ]。在海拉细胞(Hela cell)和已分化的Caco22细胞的核提取物中,利用电泳迁移率变动分析,发现变异型T-13910和核因子之间存大很强的相互作用;与之相反的是,变异型C-13910与核因子只有微弱的相互作用,表明变异型C-13910 和T-13910 LCT启动子活性的差异是由于它们与核因子亲和力不同[ 17 ]。
乳糖酶增强子至少由Oct-1、GATA、叉头框和HNF24α结合位点构成,变异型C /T-13910位于增强子的中央。C-13910和T-13910的增强子活性也存在很大差异,变异型T213910转录活性是C-13910的3～6倍。用含有T-13910的DNA片段进行DNA亲和提纯分析表明,八聚体结合转录因子(Oct21)与32磷酸甘油醛脱氢酶共纯化。Zheng等[ 18 ]证明, 32磷酸甘油醛脱氢酶与Oct21具有相互作用,这可以解释为什么二者共纯化。超迁移分析表明, Oct21能直接同变异型T-13910结合,且强于Oct21与变异型C-13910之间的结合[ 19 ]。变异法分析T-13910增强子上Oct21结合位点,发现这个位点变异后乳糖酶表达产物减少一半。同理,应用变异法分析GATA、叉头框和HNF24α与T-13910 增强子的结合位点,发现这些位点变异后T-13910增强子的活性显著地降低了,表明这几个结合位点是T-13910 增强子的重要因子,可能参与调节乳糖酶表达。与之相反的是, Cdx-2结合位点的变异对T-13910增强子的活性无显著作用。Oct-1、GATA-6、HNF-4α、Cdx-2、HNF-1α、HNF-1β和T-13910 增强子共转染分析证明, Oct-1只有和HNF-1α一起同时结合到相应的位点,才能激活报道基因的表达。虽然HNF-1α结合基序位于C /T-13910增强子之外,但HNF-1α很可能通过与启动子结合发挥作用。对变异型G/A-22018进行类似的分析并未发现ATH者G/A-22018表型的不同所造成的启动子活性显著差异[ 16-17 ]。
3 小 结
LD在人群中的患病率高,其中最常见的类型是ATH,影响了全世界约60亿人口。随着牛奶和奶制品消费者的增加,L I的问题逐渐得到人们的重视。近半个世纪以来,关于这方面的研究比比皆是,并且已经深入到基因水平,目前已经能通过基因诊断早期发现LD个体,然而对于乳糖酶基因表达的调控机制尚未完全明确,有待于今后的研究来阐明。
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来源：医学综述 作者：宋惠雯,王承党
