水稻纹枯病(rhizoctonia solanii)是我国水稻三大主要病害之一,由于纹枯病菌腐生能力强,寄主范围广,尤其是随着水稻优质品种的推广和高肥密植技术的应用,该病危害日趋严重,每年都会给水稻生产造成一定损失,直接威胁水稻的稳产高产。水稻不同品种间对纹枯病的抗性虽有一定的差异,但至今尚未发现免疫和高抗品种。目前,特效药井岗霉素防治纹枯病已使用多年,极易诱导抗药性产生或有的已产生抗药性[1～3] 。近年来,国外主要水稻产区,普遍开展了水稻纹枯病的生物防治研究工作。我国对纹枯病的拮抗细菌研究较少[4～5] 。自2000年开始,本课题组成筛选出芽孢杆菌Drt-11和该菌的发酵制剂在生产上用于防治纹枯病,为水稻纹枯病的生物防治提供可行的方法和依据。
1 材料与方法
1.1 试验水稻品种
冈优527由四川省种子公司提供,在试验场和田间均按常规方法准备稻苗。
1.2 供试病原菌
水稻纹枯病病原菌由四川省农科院植物保护研究所提供。对照农药为20%井岗霉素可湿性粉剂,由湖北省武汉科诺生物农药有限公司生产。
1.3 芽孢杆菌Drt-11
芽孢杆菌Drt-11由四川省农科院植物保护研究所提供。按照《一般细菌常用鉴定方法》和《芽孢杆菌属》的方法和标准、以Bacill us subtilis , B1lichenif ormis 和B1cereas 作为参照菌,通过鉴定证明该菌Drt-11为芽孢杆菌( Bacill us spp1) 。
1.4 芽孢杆菌Drt-11在田间植株上的定殖能力测定
在水稻苗期,将芽孢杆菌Drt-11发酵液(3.6 ×105 cfu/mL) 喷施在水稻植株上,从接种后第1天开始观察记载叶片上每平方厘米的菌体数量变化。
1.5 芽孢杆菌Drt-11对菌核萌发作用的影响
把水稻纹枯病菌核分别放入无菌水和芽孢杆菌Drt-11发酵液剂中,分别振荡(100～150r/min) 10min、1h和24h以上,取出菌核用无菌水冲洗3 次,然后分别移入PDA 培养基中,24h后观察菌核萌发数,72h测定菌落大小,每处理30 个菌核。
1.6 芽孢杆菌Drt-11发酵参数测定
1.6.1 发酵基质的筛选
选择鱼粉、花生饼、豆饼、玉米、KB 液5 种发酵基质作为芽孢杆菌Drt-11的发酵基质,将100mL 的基质分别装在500mL 的三角瓶中,在温度、发酵时间、pH、转速、母菌量相同的条件下培养,48 和72h后观察芽孢杆菌Drt-11的产孢量。
1.6.2 不同温度对产孢的影响
设实验发酵温度为25 、28 、31、34 、37 ℃,培养一定时间后,取不同温度的发酵液,测定其菌体数量(cfu/mL) 。
1.6.3 pH 对产孢的影响
设发酵液中pH 为510 、6.5 、7.0 、7.5 、8.0 ,在28 ℃±1℃的条件下培养,测定其菌体数量(cfu/mL) 。
1.6.4 供氧量对产孢的影响
500mL 三角瓶分别装入50 、100 、150mL 不同量的改良KB 液体培养基,接菌量按发酵液的1%计算。最终测定培养48h 后,50 、100 和150mL 液体中芽孢杆菌的菌体数量(cfu/mL) 。
1.7 芽孢杆菌Drt-11发酵液促生作用测定
取旱地耕作层土壤,充分混匀后等量(310kg)装盆,加等量水后,每盆播已用细菌悬液浸种的冈优527 稻种100 粒,重复5 次,以清水浸泡为对照,置室外盆栽。适时取全部苗测定株高、地上、地下部的生物产量。
1.8 芽孢杆菌Drt-11发酵液的田间防治效果测定
试验设在资中县,前茬作物为小麦田,处理分别为Drt-11发酵制剂,20%井岗霉素WP (CK1) 为药剂对照和清水对照(CK2) 。每个处理4 次重复,每重复小区面积30m2 。各小区双埂包膜隔离,小区间距和小区与保护行间距为80 cm ,保护行品种为岗优527 。
移栽前,用玉米粉培养的纹枯病菌与河沙混匀混合。每小区200 g ,均匀撒栽小区内,于分蘖盛期和孕穗期进行防治。根据水稻叶鞘和叶片危害症状程度分级,以株为单位每小区对角线五点取样,每点调查相连5 丛,供25 丛,记录总株数、病株数和病级数。0 级:全株无病;1级:第四叶片及以下各叶鞘、叶片发病(以剑叶为第一片叶) ;3 级:第三叶片及以下各叶鞘、叶片发病;5 级:第二叶片及以下各叶鞘、叶片发病;7 级:剑叶叶片及以下各叶鞘、叶片发病;9 级:全株发病,提早枯死。
2 结果与分析
2.1 芽孢杆菌Drt-11在田间植株上的定殖能力
试验观察发现,田间自然状态下,生防菌Drt-11表现出较强的附着能力和自身的增殖能力,具有控制病害发生和发展的能力,喷雾15 d 后,菌体数量下降,逐渐失去控制病害发生的能力(表1) 。芽孢杆菌Drt-11可以在水稻叶面和叶鞘处定殖,这与纹枯病病原菌主要是从叶鞘处侵入部位相同,因此,芽孢杆菌Drt-11能有效的阻止病原菌的侵入。根据试验结果证明菌体在田间水稻植株上的定殖情况,该制剂在田间防治稻瘟病的最佳间隔期为7～10 d。
2.2 不同发酵基质对芽孢杆菌Drt-11的产孢影响
经对5 种发酵基质的筛选,以鱼粉为主要基质的发酵液,产孢量和产孢率无论在48h还是72h,都比其他4 种发酵液高,48h达到25.8×10 8cfu/mL 、86.3%和72h达到36.2×10 8cfu/mL 、89.7%。其次是以花生饼为主要原料的发酵液,产孢量和产孢率48h达到18.6×10 8cfu/mL 、80.2%和72h达到19.6×10 8cfu/mL 、85.3%。通过该比较实验证明鱼粉和花生饼是芽孢杆菌Drt-11的理想发酵基质。
2.3 温度对芽孢杆菌Drt-11产孢的影响
实验测定,25 ℃时芽孢杆菌增长量不显著,在温度28 ℃时芽孢杆菌数量增长显著,达到5.66 ×10 8cfu/mL ,31～37 ℃之间,芽孢杆菌数量增长趋于稳定,变化不大,芽孢杆菌数量稳定在10 9cfu/mL左右。实验结果证明,温度34℃是发酵培养芽孢杆菌Drt-11的最佳温度(图1) 。
2.4 芽孢杆菌Drt-11最佳发酵时间测定
实验观察,0～12h内为Drt-11菌体延滞生长时期,菌体生长繁殖缓慢,12～36h为生长加速期,菌体繁殖高峰时期,发酵液内菌体数量明显增加,36～48h为平稳时期,菌体数量达到稳定,72h以后为衰亡期,活菌由于自身产生的分解物质而使菌体分解,发酵液变透明。最佳收菌时间为发酵后36h(图2) 。
2.5 pH对芽孢杆菌Drt-11发酵影响
当pH510 时,芽孢杆菌数量基本稳定在液体的原始浓度,当pH = 6/5 时,芽孢杆菌数量开始增长,但增长速度缓慢,48h仅为7/6 ×107 cfu/mL ,72 h为9/5 ×107 cfu/mL 。随着pH 升高,芽孢杆菌数量明显增加,pH 为7.0 时,杆菌数量达到最高:48h为3.01×109 cfu/mL ,72h为3.37 ×109 cfu/mL ,当pH > 7.5 时,芽孢杆菌数量开始下降。实验证明,pH = 7.0 是芽孢杆菌生长的最佳pH(图3) 。
2.6 供氧量对芽孢杆菌Drt-11产孢影响培养36～60h,是50 和100mL 装量的最佳放菌时间,此时,发酵液里菌体数量最高,可达到9.3×109 和8.5 ×109 cfu/mL 。在接种量相同的条件下,在500mL 三角瓶中的最佳装量为100mL 。
2.7 芽孢杆菌Drt-11的最佳发酵参数确定
在无菌条件下,将在小摇床上培养24～48h的芽孢杆菌Drt-11转入发酵瓶内,接菌量按发酵液的1%计算。发酵温度为28～30 ℃,搅拌速度为180～200r/min ,pH 为712～713 ,通气量为1∶1,发酵基质主要为鱼粉和豆饼, 及适量的FeSO47H2O、KCl ,在测定发酵液中芽孢杆菌数量达到108～9 cfu/mL 后,放罐收菌。发酵液为不透明的淡黄色液体,静止后发酵液有沉淀生成。
2.8 芽孢杆菌Drt-11对稻苗生长发育的影响
芽孢杆菌Drt-11对稻苗生长的促生性明显,主要表现在稻苗生物量的增加,地上、地下部干重以及株高分别较对照增加5.17% ,25.09%和4.09%。
2.9 芽孢杆菌Drt-11发酵液对水稻纹枯病病原菌菌核的抑制作用
研究结果表明,菌核在Drt-11发酵液中处理10min ,菌核能萌发,菌丝生长不受影响,处理1h后,菌核的萌发受到抑制,病菌生长受明显抑制,随着处理时间延长,抑制率提高(表4) ,在发酵液中处理24h 后,菌核萌发减少40%～60% ,菌落生长半径是对照的13.9% ,证明菌核在发酵液中处理时间越长,其萌发率越低,菌丝生长越慢,镜检发现病原菌菌丝肿大变形。
2.10 芽孢杆菌Drt-11发酵制剂防治纹枯病田间试验效果测定与评价
Drt-11发酵制剂对水稻纹枯病具有显著的控制效果(表5) ,4 年多点田间试验结果显示,供试拮抗菌Drt-11发酵制剂防治纹枯病效果稳定在80%～85%之间,与对照药剂20%井岗霉素的防治效果相当。根据实际小区测产结果(表6) ,供试芽孢杆菌Drt-11发酵制剂处理均有显著的保产作用(6.91%～18.13%) 。
2.11 芽孢杆菌Drt-11发酵液制剂与20%井岗霉素WP混配使用
在田间Drt-11发酵液和20%井岗霉素混配使用,各处理间病情指数在P<0.05 和P < 0.01的情况下,病指存在显著差异。防治效果比净用Drt-11发酵液提高7.63%～9.26% ,比单用20%井岗霉素WP 提高11.20%～12.77% ,3 种不同比例的混配,其防治效果分别是:90.43%、92.05%和86.38%。除混配3 (Drt-1150mL ,20%井岗霉素3.75g) 外,混配1和2 的防治效果都比单用Drt-11发酵液和20%井岗霉素高(表7) 。综上所述,田间防治水稻纹枯病试验证明,Drt-11发酵液能够有效控制纹枯病的发生,田间防效稳定,是一种很好的微生物杀菌剂。
3 讨 论
3.1 生防菌的定殖和繁殖
芽孢杆菌Drt-11在植物表面上的定殖能力反映了生防菌在植物表面与病原菌竞争空间和营养的能力。本文研究表明,芽孢杆菌Drt-11进行叶面喷雾后,可以在水稻叶面和叶鞘处定殖,这与纹枯病病原菌主要是从叶鞘处侵入部位相同,因此,芽孢杆菌Drt-11能有效的阻止病原菌的侵入。从试验观察发现,芽孢杆菌Drt-11首先在定殖位点有一个适应期,表现为菌量有所下降,适应期后Drt-11菌在定殖处开始繁殖,Drt-11菌在水稻植株上的变化趋势与其防病的持久期相吻合。芽孢杆菌Drt-11在植株体内是否可以传导,尚需做进一步的研究。
3.2 田间防治效果的变异
在4 年的田间防治试验中,防治效果出现不稳定现象,笔者认为,主要是田间存在许多错综复杂的因素互相作用引起,如受外界因素的影响会造成生防菌的退化,生存能力降低,拮抗菌本身产生抗菌物资的能力降低或丧失,立枯丝核菌产生变异,环境条件发生变化,不利于生防因子发生作用或生防因子失去活性,这些都是造成Drt-11发酵制剂防治效果不稳定原因。
3.3 芽孢杆菌Drt-11存在的问题
本研究虽然对芽孢杆菌Drt-11作了一些初步试验,并发现具有作为生物农药的潜力,但对该菌种的鉴定、有效成份的分离、结构鉴定、发酵条件的最佳优化和安全性试验等方面的研究工作则还有待进一步深入研究。
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