1 前言
苏云金芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ,简称Ｂｔ)的工业生产普遍采用深层发酵法,产生的伴孢晶体、芽孢、营养期杀虫蛋白(Ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌｐｒｏｔｅｉｎ)以及ＺｗｉｔｔｅｒｎｉｃｉｎＡ等增效因子是其主要的活性成分[1～3]。发酵液后处理的核心问题就是将伴孢晶体等杀虫成分及其增效因子与发酵液分离,去除占质量90%以上的水分,得到干燥的工业原粉。为了不破坏发酵液的杀虫活性,浓缩过程要遵循“低温、快速”的原则。发酵液的浓缩处理主要有板框压滤法[4]、减压浓缩法[5]和离心分离法。板框压滤法是苏云金芽孢杆菌工业生产较早采用的一种浓缩方法,过滤前需要加入大量惰性填料,很难获得高效价粉剂。减压浓缩法是在较低温度下将发酵液浓缩到一定体积的方法,存在能耗高、效率低等缺点,目前已较少使用。离心分离法仍是目前苏云金芽孢杆菌大规模生产中应用最广的方法,但上清液的分离造成了增效成分流失[6]以及晶体、芽孢的损失,发酵液离心分离脱除69%的上清液后,浓缩液的效价损失53.4%、晶体损失11.3%[7]。在这种形势下,探讨新的后处理工艺、减少杀虫活性物质损失是苏云金芽孢杆菌生产厂家亟待解决的问题。
2 发酵液浓缩进展
2.1 超滤法超滤是一种在加压下物质通过滤膜的分离技术。在泵的作用下,发酵液在超滤膜上运动,大于膜孔径的物质被截留下来,小于膜孔径的物质则通过滤膜被分离。这是一种过程简单、无相变发生、无外加助剂且能耗极少的分离手段,超滤范围可以根据超滤膜孔径大小将分子量500～1000000ｋＤａ之间的物质与水相分离。陈锦权等[8]在国内率先开展了超滤法浓缩苏云金芽孢杆菌发酵液的研究工作,超滤装置见图1。
超滤膜采用聚砜材料膜或醋酸纤维素膜。超滤膜安装完毕后,向循环罐中加入发酵液,开启泵,通过调节进出口阀压力,使发酵液流速为1～2ｍ·ｓ-1。随着水分的不断排除,发酵液浓度不断提高,超滤通量逐渐缓慢下降,当发酵液浓缩至初浓度的5～6倍时,停止超滤,浓缩液用于干燥或制剂处理。采用醋酸纤维素膜或聚砜材料膜为介质超滤,由于芽孢和晶体的直径大于超滤膜的孔径,芽孢和晶体的透过率为0,回收率100%。超滤膜有较长的使用寿命,半衰期为43～50ｄ[9]。使用超滤浓缩法最大的缺点就是超滤速度下降问题,为了保证足够的超滤通量,超滤膜要及时清洗。任冬伟等[10]在超滤Ｂｔ发酵液时,采用了超滤膜进出口端互换运行法,可以在超滤过程中让原来堵塞的膜管得到清洗,较大程度地恢复膜通量。阮传清等[11]研究了500～6000ｋＤａ9种不同孔径分子筛对Ｂｔ发酵液的浓缩效果,结果表明这9种规格孔径的分子筛膜得到的滤出液都检测不到晶体和芽孢的存在,晶体和芽孢的回收率为100%。但超滤液通量随着膜孔径增大而增大。发酵液固形物含量越低,分离时间越短、浓缩比越高。当固形物含量在1 5%时,分离时间为20ｍｉｎ、浓缩比为8.667;而固形物含量为15%时,分离时间延长到69ｍｉｎ、浓缩比降为1.348。采用无机膜处理Ｂｔ发酵液可以提高产率,实现清洁生产[12]。Ｂｔ发酵液经第一级无机膜过滤,伴孢晶体、芽孢等物质被截留,浓缩4 3倍。得到的上清液由第二级无机膜处理,将分子量大于700ｋＤａ的物质截留,浓缩8倍。将第一级膜和第二级膜的浓缩物混匀,添加增效剂、分散剂等物质后干燥,即为农药干粉成品。无机膜浓缩工艺与离心浓缩相比,电耗降低45%,污水的ＣＯＤ由31000ｍｇ·Ｌ-降至2500ｍｇ·Ｌ-1,产品收率达80%以上。
2.2 沉淀法凝聚和絮凝技术能有效地改变细胞、菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态,使其聚集起来形成固形物沉淀。通常发酵液中的细胞、菌体或蛋白质等胶体粒子的表面带有负电荷,由于静电吸引而形成双电层结构,带有相同电荷的双电层相互靠近时,静电排斥使两个颗粒分开,阻止了凝聚。发酵液中加入具有高价阳离子的电解质,可以降低双电层的电动电位,脱除颗粒表面的水化膜,导致颗粒凝聚。根据这一原理,王涛[13]采用明矾部分或全部代替盐酸调节苏云金芽孢杆菌发酵液的ｐＨ值,对杀虫活性成分进行絮凝,沉淀后除去部分上清液,根据发酵液效价的不同而浓缩到一定的体积,便可直接调配成液剂。若制造可湿性粉剂则需在发酵液中加入珍珠岩粉,除去上清后进行干燥处理。根据Ｓｃｈｕｌｚｅ Ｈａｒｄｙ法则,反离子价数越高,凝聚能力就越强,阳离子对带负电荷的胶粒凝聚能力的次序为:Ａｌ3+>Ｆｅ3+>Ｈ+>Ｍｇ2+>Ｋ+>Ｎａ+>Ｌｉ+。常用的凝聚剂电解质有:明矾、三氯化铝、三氯化铁、硫酸锌等。沉淀法操作简便、无需特殊设备,但花费时间长、容易污染。
3 发酵液杀虫活性成分回收进展
3.1 发酵液直接喷雾干燥工业生产中一般不将发酵液直接喷雾干燥,因为直接干燥不仅耗费大量能源,而且培养基残留营养成分混入制剂易于吸潮。发酵液通过浓缩处理达到一定浓度后,喷雾干燥的蒸发负荷会大大减轻,物料粘壁现象也会明显改善。为了解决发酵液离心浓缩带来的毒力效价严重损失的问题,杨自文等[14]对发酵液直接喷雾干燥进行研究,发现发酵液未经任何处理直接喷雾干燥,得到的粉剂含水量为9 4%,其效价和晶体收率分别为95.7%和99.8%;而当发酵液中添加6.8%碳酸钙后直接喷雾干燥,得到的粉剂含水量4.5%,效价和晶体收率分别为100.6%和101.7%。可见发酵液添加碳酸钙喷雾干燥可以改善物料性状、提高菌粉收率和质量。进一步分析可知,若仅考察喷雾干燥这一过程,效价和晶体的损失率很小,因此发酵液直接喷雾虽然能耗高,但原粉和效价收率的提高有可能完全补偿能量消耗,对降低生产成本和提高生产效率具有积极意义。
3.2 发酵液直接回收杀虫毒素苏云金芽孢杆菌发酵液成分复杂、晶体蛋白含量较低,制备高效价的Ｂｔ液剂和粉剂均有一定难度。ＬｉｕＢＬ等[15]采用碱溶-超滤法直接从发酵液中提取碱溶的68ｋＤａ晶体蛋白毒素,取得较好杀虫效果。发酵液首先在60℃保温20ｍｉｎ,目的是提高蛋白酶的活性,加速伴孢晶体的碱溶降解。用1ｍｏｌ·Ｌ-1的ＮａＯＨ调节发酵液ｐＨ12,维持5ｈ。离心除去不溶物,上清液用6ｍｏｌ·Ｌ-1的ＨＣｌ调至ｐＨ8.4,再次离心除去不溶物,上清液超滤截留10ｋＤａ以上的蛋白质,得到的主产物为68ｋＤａ的碱溶蛋白。该方法的技术关键是碱溶5ｈ后要及时将发酵液ｐＨ值调回8.4,否则得到的碱溶蛋白杀虫毒力难以恢复。经用5Ｌ发酵液进行试验,碱溶晶体蛋白回收率达80%以上。提取的碱溶毒素对菱纹背蛾具有较高的致死率,具有大规模试验的可行性。
3.3 苏云金芽孢杆菌增效物质的回收苏云金芽孢杆菌某些亚种的发酵上清液中含有一类对Ｂｔ晶体蛋白有显著增效作用的可溶性物质,能否回收这些Ｂｔ增效物质,是提高Ｂｔ制剂效价的关键。ＫＮ- 11增效物质为一种性质类似于ＺｗｉｔｔｅｒｎｉｃｉｎＡ(分子量为396Ｄａ)的水溶性物质,采用膜过滤技术可以将其回收。将一定体积原液(上清液或发酵液)依次通过微滤膜(孔径为0 1μｍ)、超滤膜(截留分子量为10000Ｄａ)和纳滤膜(截留分子量为200Ｄａ)过滤处理。第一步用微滤膜除去上清液或发酵液中直径大于0.1μｍ的不溶性杂质(如菌体、伴孢晶体、芽孢和培养基残渣),同时加10Ｌ水洗涤微滤后剩余的浓缩液,洗涤液再经过微滤,合并两次微滤滤液。第二步用超滤膜除去微滤滤液中分子量大于10000Ｄａ的可溶性杂质(主要是可溶性蛋白),同上加10Ｌ水洗涤超滤后剩余的浓缩液,洗涤液再经过超滤,合并两次超滤滤液。第三步超滤滤液经纳滤膜通过反渗透作用除去分子量小于200Ｄａ的可溶性杂质和大部分水分,且纳滤终管道清洗液返回浓缩液,最后收集含有ＫＮ-11增效物质的纳滤浓缩液,喷雾干燥,得到增效物质粉[16]。膜过滤技术对苏云金芽孢杆菌ＫＮ-11增效物质总回收率达到85 5%,同时除去了大部分的糖、氮等可溶性杂质,使浓缩液和增效物质粉保持了较好的理化性状。膜过滤工艺的浓缩液与普通Ｂｔ菌浆进行混合,所配制的Ｂｔ高含量悬乳剂的效价在15645～19465ＩＵ·μＬ-1之间,含固量较低且流动性较好。增效物质粉与效价55000ＩＵ·ｍｇ-1的Ｂｔ原粉复配,高含量原粉效价可达100646ＩＵ·ｍｇ-1。
