苏云金芽孢杆菌“９４００１”是作者于 １９９４ 年从甜菜夜蛾幼虫尸体中分离获得的一株对鳞翅目昆虫高毒的优良菌株。经实验室生物测定和田间试验示范， 该菌株对抗性小菜蛾、棉铃虫、松毛虫和甜菜夜蛾低龄幼虫均有较高的杀虫毒力。目前， 高毒苏云金芽孢杆菌的选育， 特别是高毒广谱工程菌株的构建成为研究的热点。为了获得高效优质产品， 作者以培养温度、通气量、搅拌速度为因素， 采用正交设计［１］方法， 对 Ｂｔ“９４００１”发酵工艺进行了优化研究。
１ 材料和方法
１．１ 菌株
Ｂｔ“９４００１”系作者分离保藏的菌株； 对照菌株Ｂｔ Ｃ－ ９１ 由瑞士 Ｃｉｂａ－ Ｇｅｉｇｙ 公司提供， ＢｔＭＰ－ ３４２是本中心实验室分离的菌株。
１．２ 培养基
斜面培养基： 牛肉膏 ５．０ ｇ， 蛋白胨 １０．０ ｇ， ＮａＣｌ５．０ ｇ， ｐＨ６．８～７．０， 水 １ ０００ ｍＬ。发酵培养基： 豆饼粉２０．０ ｇ， 生饼粉 １８．０ ｇ， 淀粉 １８．０ ｇ， 酵母粉 ４．０ ｇ，ＣａＣＯ３１．０ｇ，ＣａＣｌ２１．０ｇ，ＭｇＳＯ４０．３ｇ，添加剂Ⅰ号 １０．０ｇ，灭菌后 ｐＨ 值 ６．７， 水 １ ０００ ｍＬ。
１．３ 发酵工艺条件优化试验
以培养温度、通气量和搅拌速度为因素， 采用正交设计方法在 ２．３ ｍ３ 发酵罐中进行工艺条件优化试验。投料体积按总体积的 ６５％计。
１．４ ４０ ｍ３ 发酵罐 ３ 批验证试验 本试验按总体积的 ６５％投料， 添加消泡剂４０ｋｇ， 消毒灭菌， 冷却后以压差法接入 ４００ ｍＬ（ １ 亿个芽孢·ｍＬ－１）孢子悬浮液， 发酵过程按优化条件控制。待 ３０％以上芽孢晶体脱落后终止培养， 测定生物效价和晶体蛋白含量。
１．５ 效价测定
以 ＣＳ３ａｂ－ １９９１（１５ ０００ ＩＵ·ｍｇ－１）为参照标准品，室内饲养的健康棉铃虫幼虫为供试昆虫， 按规定程序操作［２］。
１．６ 晶体蛋白含量测定
采用 ＳＤＳ 凝胶电泳， 利用 Ｉｍａｇｅ－ ＩＤ 软件， 通过计算机扫描凝胶测定［２］。
２ 结果与分析
２．１ 发酵工艺条件优化结果
按表 １Ｌ９（３４） 因素水平进行发酵工艺条件优化试验， 以获得 Ｂｔ“９４００１”菌株的最佳发酵工艺参数。正交设计方案和发酵工艺条件优化结果见表 １、表２。表 ２ 结果显示， 发酵生物效价达到 ４０００ＩＵ·μＬ－１ 以上， 晶体蛋白含量达到 ０．４０％以上的组合为 １、３、７和 ８ 号。其中 ７ 号发酵生物效价和晶体蛋白含量分别高达 ６ ８４７ ＩＵ·μＬ－１ 和 ０．５６％。
２．２ ４０ ｍ３ 发酵罐验证试验结果
以 ８ 号工艺条件为基础， 发酵过程控制均模拟２．３ ｍ３ 发酵罐实施。发酵结束后调节 ｐＨ 值至 ６．０，采用 ＤＢＰ－ ５０ 型分离机进行浓缩， 喷雾干燥获得旋风粉和塔底粉。粉剂质量检测结果见表 ３。
３ 结论
１） 通过 ２．３ ｍ３ 发酵罐发酵工艺条件优化试验和 ４０ ｍ３ 发酵罐验证试验， Ｂｔ“９４００１”菌株在选定的培养基， 获得的最佳发酵工艺条件是： 通气量１：０．５～１．２Ｖ·Ｖ－１·ｍｉｎ－１， 恒温３４℃， 搅拌速度２５０ｒ·ｍｉｎ－１。
２） 作者对 Ｂｔ“９４００１”菌株的多年研究发现， 该菌株比一般 Ｂｔ 在发酵性能上有两大优势。其一是耐高温， 在 ３７℃温度下发酵仍能产生正常的高毒力的晶体蛋白， 本试验在 ４０ ｍ３ 发酵罐 ３４℃温度下发酵，发酵效价和晶体蛋白含量分别高达 ６ ４８４ ＩＵ·μＬ－１和 ０．６１％； 其二是有极强的抗噬菌体能力。因此， Ｂｔ“９４００１”菌株是目前我国发掘出来的一株毒力强、发酵性能好的优良菌株。
参考文献：
［１］ 徐吉民．正交法在医药科研中的应用［Ｍ］．北京： 中国医药科技出 版社．１９８７．
［２］ 吴继星， 陈在佴， 张志刚．对甜菜夜蛾高毒苏云金芽孢杆菌菌株的选育［Ｊ］．微生物学通报， ２００４， ３（３）：２５－ ２９．
