苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)以其独特的产伴胞晶体蛋白(内毒素，ICPs)的能力使它成为目前世界上使用最广泛的杀虫微生物．从20世纪70年代起，苏云金芽胞杆菌在生物防治方面得到了广泛地应用，主要用于农、林、牧等领域虫防治[1]．随着新菌株的发现以及分子克隆技术应用，它的应用范围还在不断扩大_J ]，使得Bacil—lus thuringiensis发酵过程研究成为研究热点．为降低生产成本和提高发酵水平，许多学者在菌种的筛选和基因工程菌的构建、发酵原料的选择、培基的优化以及发酵过程中相关参数对发酵水平的影响等方面都作了大量的研究 ]．目前国内采用分批发酵生产Bacillus thuringiensis，且一般都通过提高培养基的浓度来提高发酵水平，但由于底物抑制作用和供氧的限制很难达到好的效果[s ．补料发酵介于分批发酵和连续发酵，兼有两者的优点，可以很好地解决上述两个问题．在Bacilluethuringiensis的补料发酵研究方面，由于以前的补料研究以提高生物量或芽孢数为目的，从而使得生物量和芽孢数到达了l0 个以上[7j，但发酵水平幅度下降 ]．作者对不同发酵时期补加葡萄糖对发酵水的影响做了研究，以期探讨不同时期的葡萄糖补加对菌体生成、芽孢合成、晶体蛋白表达以及发酵水平的综合影响．
1 材料与方法
1．1 菌种
苏云金芽胞杆菌工程菌BMB005，由作者所在实验室构建并保存．
1．2 培养基
1．2．1 种子培养基组分(g／L)：牛肉膏5．0，蛋白胨l0，NaC1 5．0．PH 7．2．
1．2．2 发酵培养基H， 组分(g／L)：液化玉米淀粉30，黄豆饼粉20，蛋白胨20，KH2 PO 1．0，M gSO ·7H，O 0．35．PH 7．0．
1．3 培养方法
将斜面菌种转接到种子培养基中，30℃下l50r／min培养7 h，再将种子液以体积分数0．5 的接种量接种到发酵培养基中进行发酵．为了消除供氧不足对发酵的影响，在摇瓶发酵时，将发酵培养基的浓度减半，并采用一次性补加方式；在30 L的B．Braun发酵罐中采用恒速连续补加的方式．
1．4 分析方法
1．4．1 晶体含量测定 先进行SDS—PAGE 电泳，再用Image—Master软件进行定量分析．
1．4．2 生物效价测定 以棉铃虫作为供试虫，按《中华人民共和国农业行业标准NY293—95苏云金芽胞杆菌制剂》⋯ 规定的方法测定．
1．4．3 生物量测定稀释平板记数法
1．4．4 同步率测定显微记数法
1．4．5 还原糖质量浓度测定DNS法
2 结果与分析
2．1 摇瓶发酵中对数生长期补加葡萄糖对菌体生长和杀虫晶体蛋白合成的影响
苏云金芽胞杆菌发酵过程主要分为4个阶段：延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期u]．在对数生长期，细胞数目以指数形式增长．在半倍的H 发酵培养基中，对数生长期补加0．5 g／dL和1．0 g／dI葡萄糖可显著提高生物量(a一0．1)，而对数生长期补加1．5 g／dL和2．o g／dL葡萄糖对生物量没有显著性影响，见表1．
表1 对数生长期补加不同质量浓度的葡萄糖的摇瓶发酵试验结果
Tab．1 Results of flask fermentation by feeding glucose at the exponential phase
芽孢是Bt制剂中重要的有效性成分，它对晶体杀虫蛋白有较强的协同作用，因此它的生成对发酵水平的提高有很大的影响．通过镜检发现，对数生长期补加葡萄糖对同步率没有显著的影响．杀虫晶体蛋白是发酵液中主要的活性物质，它的质量分数的高低直接影响到发酵液的效价水平 ，因此提高菌体合成晶体蛋白的能力和发酵液的晶体质量浓度成为提高发酵水平的重要途径．通过补加不同质量浓度的葡萄糖发现：对数生长期补加葡萄糖有助于提高发酵液中晶体质量浓度，但当补加葡萄糖超过1．0 g／dL以后，发酵液中晶体质量浓度有降低的趋势．与对照相比，对数生长期补加葡萄糖对菌体合成晶体蛋白的能力没有显著影响．由此可见，对数生长期补加葡萄糖主要是通过提高生物量，进而提高发酵水平的．另外，总糖对晶体蛋白的转化率随着补糖质量浓度的升高而降低．
2．2 摇瓶发酵中稳定期补加葡萄糖对菌体生长和杀虫晶体蛋白合成的影响
在发酵稳定期，生物量基本上保持不变，芽孢和晶体以及大部分增效因子均在此阶段大量形成在半倍的H。培养基中，考察发酵稳定期补加不质量浓度的葡萄糖对发酵的影响．结果表明：在稳定期补加不同质量浓度的葡萄糖对生物量没有著影响，但对同步率的影响显著(见表2)．补加0．g／dL和1．0 g／dI 的葡萄糖时同步率总是维95 以上，而补加1．5 g／dL和2．0 g／dL的时同步率分别为86 和79 ．可见稳定期补加过的葡萄糖会降低芽孢形成的同步率．稳定期补加0．5 g／dL和1．0 g／dL葡萄糖会使发酵液中晶体质量浓度分别提高15．0 和18．1 ，而稳定期补加2．0 g／dL葡萄糖会使发酵液中晶体质量浓度降低22．8% ，这可能是由于过高的葡萄糖质量浓度使部分菌体减缓进入芽孢合成期的速度，导致同步率下降，进而降低发酵液中晶体的质量浓度．另外补加0．5 g／dL和1．0 g／dL葡萄糖可使菌体合成晶体蛋白的能力分别提高14．1 和15．5 %，而补加2．0g／dI 葡萄糖会使合成能力大幅度降低．由此可见，稳定期补加适量的葡萄糖可以提高菌体自身合成晶体蛋白的能力，进而提高发酵水平．和对数生长期补加一样，在稳定期补加葡萄糖会使总糖对晶体蛋白的转化率降低．
表2 稳定期补加不同质量浓度的葡萄糖的摇瓶发酵试验结果
Tab．2 Results of flask fermentation by feeding glucose at the stationary phase
2．3 30 L发酵罐系统中不同发酵阶段补加1．0g／dL葡萄糖对发酵的影响
为了进一步验证补加葡萄糖的效果，在3O L发酵罐中进行不同发酵阶段补加1．0 g／dL葡萄糖的发酵试验．对数生长期恒速补加葡萄糖可以使发酵液的晶体蛋白质量分数和生物效价分别提高37和51 ，而稳定期恒速补加葡萄糖可以使发酵液的晶体蛋白质量分数和生物效价分别提高33．7 和75．1 (见表3)．
表3 30 L发酵罐中不同时期补加1．0 g／dL葡萄糖的发酵结果
Tab．3 Fermentation results by feeding 1．0％ glucose at different growth phases in a 30 L fermentor
与对数生长期补加葡萄糖相比，晶体蛋白质量分数提高幅度稍低，但效价提高的幅度要大得多．与摇瓶实验相比，在发酵罐中补加1．0 g／dL的葡萄糖对y 。 影响较小，可见发酵罐中葡萄糖的利用率要比摇瓶中高．在稳定期随着还原糖的利用，发酵液的pH值不断降低，直到稳定在6．6左右，临近发酵结束时pH 值才开始上升，发酵结束时的pH值在7．5左右(图1，2)．
这是由于在芽孢形成期苏云金芽胞杆菌的丙酮酸脱氢酶系发生解离，使得丙酮酸不能进入三羧酸循环，稳定后期补加的葡萄糖大部分被转化成有机酸，从而发酵液pH值稳定在中性附近．和对照相比，稳定期补加葡萄糖不仅有助于提高菌体合成杀虫晶体蛋白能力，同时还有助于增效因子的产生．
3 讨 论
发酵液的效价不仅与芽孢和杀虫晶体蛋白有关，还与菌体自身产生的增效因子有关n]，因此要提高发酵水平必须综合考虑．C．Avignone Rossa研究发现，提高生物量并不一定就会提高发酵水平，甚至会使发酵水平大幅度降低 ]，可见提高菌体自身合成杀虫活性物质的能力同样重要．在摇瓶实验参考文献：中，对数生长期补加1．0 g／dL葡萄糖可显著提高菌数(a一0．1)，同时使发酵液的晶体质量浓度提高33 ，而菌体合成晶体的能力仅提高4．2 ；与此相比，稳定期补加1．0 g／dL葡萄糖虽然对生物量没有显著性影响，但可使发酵液的晶体质量分数提高18．1 ，且菌体合成晶体的能力提高15．5％左右．从发酵罐的结果可看出，和对数生长期补加葡萄糖相比，稳定期补加适量的葡萄糖更有利于增效因子的合成．可见虽然在对数生长期和稳定期补加适量的葡萄糖都可以提高发酵水平，但两者机理截然不同．对数生长期补加葡萄糖可以显著提高生物量，进而提高发酵水平，这在可溶性发酵培养基实验中表现得更显著；而稳定期补加葡萄糖对生物量影响较小，但它可以提高菌体产生活性物质的能力，进而提高发酵水平．
