新进展：米曲霉固态发酵豆粕制备大豆肽的研究

大豆肽即大豆蛋白质经过控制性的水解、精制以后得到的一类活性肽，通常是由3~6个氨基酸组成的低分子量肽。现代研究发现许多小分子量肽在经人体消化道时不被水解，可直接被人体吸收利用，具有降血压和降胆固醇的功能，能使机体疲劳和肌肉酸感迅速消失，身体感到轻松，肌肉变得结实有力。不仅如此，大豆肽溶液还具有良好的加工性能，尤其是大豆肽在大豆蛋白的等电点pH4.3附近保持溶解状态[1]。这一酸溶特性为开发酸性大豆饮料和食品提供了条件。常用的制备方法是酶解法，但利用酶解方法产生的大豆肽具有难以脱除的苦味。

米曲霉的菌丝由多细胞组成，是一类产复合酶的菌株，除产蛋白酶外，还可产淀粉酶、糖化酶、纤维素酶、植酸酶等[2]。在淀粉酶的作用下，在淀粉酶的作用下，将原料中的直链、支链淀粉降解为糊精及各种低分子糖类，如麦芽糖、葡萄糖等；在蛋白酶的作用下，将不易消化的大分子蛋白质切成数段的小分子，即成为大豆肽，将大豆肽利用酸溶特性提取出来，发现苦味降低，同时伴有酯香味。

豆粕是大豆榨油后的副产物，其蛋白质含量高达加40%~50%，并且还有丰富的碳水化合物和矿物质。随着人们对大豆肽功能特性和营养价值的认识的加深，越来越多的专家开始研究发酵法生产大豆肽，近年来有些学者用固态发酵生产蛋白饲料。但米曲霉固态发酵法生产大豆肽的研究未见报道。本文对米曲霉固态发酵法生产大豆肽的广泛应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料 米曲霉A-9005，山东大学微生物实验室提供。豆粕，山东万得福集团生产。

1.1.2 培养基 斜面培养基：米曲霉A-9005查氏培养基[3]；液体活化培养基：米曲霉A-9005查氏培养基[3]；发酵培养基及其65%含水量配制发酵基质。配制不同豆粕与麸皮比和pH值（5.4～7.0）的条件下的豆粕，取28g分装于250mL三角瓶中，121℃，20min灭菌，待用。冷却接种，按10%接种，于不同温度下进行发酵。发酵：按

1.1.3 试剂 浓硫酸，双氧水，五水硫酸铜，硫酸钾，硒粉，硼酸，溴甲酚绿，甲基红，盐酸，氢氧化钠，以上试剂均为分析纯。

1.1.4 仪器设备 上海天平仪器厂FA2004分析天平；东联电子HZQ-Q振荡器；北京医用LG10-2.4高速离心机；苏州净化SW-CJ-2G型双人净化工作台；上海申安DSX-280AI型不锈钢手提式灭菌锅；FOSS分析公司全自动凯氏定氮仪；上海精宏MJPS-150型霉菌培养箱。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程 原料（主要为豆粕）®固态发酵®三氯乙酸提取®大豆肽提取液。

将接菌后的发酵培养基放入相对湿度90%霉菌培养箱不同温度下培养。

固体发酵：取一定量的豆粕，按不同比例加入麸皮，调pH至5.4～7.0，发酵料坯含水率调节至65％。经灭菌、冷却，用米曲霉A-9005接种，选择不同的发酵温度，发酵过程和结束后测定发酵豆粕中酸溶蛋白含量。

1.2.2 提取及计算方法 称取5g样品（精确至0.0001g），加入5mL10%三氯乙酸溶液，混合均匀，再加入10mL 5%三氯乙酸溶液，静置沉降5min后转到离心管中，在4000rpm下离心10min，取上清液并转到25mL比色管中定容[4]。

酸溶蛋白测定：按GB／T 5009.5-2003操作[5]。

大豆肽转化率（%）= 酸溶蛋白含量/原豆粕蛋白含量

2 结果与讨论

2.1 发酵时间的确定

按1.1.2方法，在90%豆粕含量、10％接种量、pH6.0、30℃培养条件下进行发酵，测定不同发酵时间时样品的酸溶蛋白含量并按1.2.3方法将其转化成转化率，结果见图1。

从图1可知发酵过程中大豆肽转化率随发酵时间增加而增加，在120h以后略有下降，在发酵96h后大豆肽转化率增加速率开始放慢，在120h达到最高点48.61％，从生产角度考虑，发酵时间定在96h，此时的大豆肽转化率达47.78％。

图1米曲霉发酵过程转化率的变化

2.2 不同豆粕含量对转化率的影响

在2.1的基础上，分别考察原料中豆粕含量为86％、89％、94％和纯豆粕对转化率的影响，结果见图2。

从图2可知豆粕含量在90％左右大豆肽转化率较高，可以到达53％左右

图1米曲霉发酵过程转化率的变化

2.2 不同豆粕含量对转化率的影响

在2.1的基础上，分别考察原料中豆粕含量为86％、89％、94％和纯豆粕对转化率的影响，结果见图2。

从图2可知豆粕含量在90％左右大豆肽转化率较高，可以到达53％左右。

图2 原料中不同豆粕含量对转化率的影响

2.2 pH值对转化率的影响

在前述实验的基础上，分别考查pH5.4、5.8、6.2、6.6、7.0等5个发酵培养基对转化率的影响，结果见图3。

从图3可知随着pH的升高大豆肽转化率是先升高后降低，pH6.6时转化率最高达53.87％。

图3 不同pH对米曲霉转化率的影响

2.2 不同发酵温度对转化率的影响

一般在工农业应用中的绝大多数微生物属于中温性微生物，其最适生长温度为25-35℃。但是生长速度高并不等于发酵速度快，更不等于代谢产物积累量大。因此，在实际生产中必须针对要求来确定培养温度。本实验采用25、28、31和34、37℃5个温度作发酵温度分别发酵，其他条件同2.3。结果如图4，从图4可知34℃时转化率最高，大约为58％。

图4 不同温度对米曲霉转化率的影响

2.5 工艺优化

根据上面单因素实验，对原料中豆粕含量、pH、发酵温度和发酵时间进行L9（34）正交试验，因素与水平见表1，试验结果见表2。

表1 正交试验因素与水平表

表2 正交试验结果

由表2可以看出，A3B3C3D3为实验的最佳组合，即：发酵料坯中豆粕含量为93％，pH为6.8，发酵温度为35℃，发酵102 h。其中豆粕含量和发酵时间的影响最大，其次是pH和温度。

对最佳组合进行双组平行试验得转化率为62.77%。

先前研究的黑曲霉AS3.350固态发酵豆粕生产大豆肽的工艺条件为发酵料坯中原料（由豆粕和麸皮组成）中豆粕含量87％、pH5.8、发酵温度30℃，发酵时间90h。在此条件下发酵豆粕中酸溶蛋白含量为62.35％。可知黑曲霉和米曲霉发酵得大豆肽转化率相差不大，米曲霉的发酵条件比黑曲霉高，发酵时间长，成本较高，但是米曲霉发酵香味较浓。

3 结论

用米曲霉A-9005固态发酵豆粕生产大豆肽的工艺条件为：发酵料坯中原料（由豆粕和麸皮组成）中豆粕含量为93％、pH6.8、发酵温度为35℃，发酵时间为102h。在此条件下发酵豆粕中酸溶蛋白含量为62.37％。

（参考文献略）