变溶菌素发酵条件的优化研究(Ⅱ)*

　　变溶菌素有着良好的应用前景。研究结果［1～4］表明, 这种由球孢链霉菌产生的溶菌酶较之卵清溶菌酶有着更为广泛的溶菌谱, 尤其是在预防和治疗龋齿方面有其独特的优点。此外, 它在食品工业中可被用作防腐剂, 延长食品的保藏期, 特别是和其它溶菌酶一起使用效果更佳;在医药上可用作灭菌剂，也可用其作用于不同菌体的细胞壁而分解产生有活性的免疫佐剂［5～8］;其重要的学术价值表现在可以作为工具酶来制备原生质体。但是, 至今未能实现变溶菌素的工业化生产, 国内外也未见有关研究报道。原因是多方面的，其中比较重要的一点就是基础研究还有所欠缺，特别是对该酶的发酵条件不够了解。我们实验室筛选得一株球孢链霉菌 S186 用于研究,本论文是在前期工作［9］ (前文曾将变溶菌素称为球孢链霉菌溶菌酶)的基础上又对其发酵条件作了更为深入细致的研究, 确立了生产工艺条件, 为从摇瓶放大到发酵罐, 以及中试和大生产打下一个良好的基础。

1　材料和方法
1.1　材料与仪器
1.1.1　菌种
　　变形链球菌 (Streptococcus mutans) Ingbritt日本九州大学齿学部赠送；
　　球孢链霉菌 (Streptomyces globisporus) S186本室分离筛选并鉴定。
1.1.2　培养基
1.1.2.1　变形链球菌培养基
　　0.5%胰蛋白胨,0.5%?蛋白胨,0.5%蔗糖,0.5%牛肉膏,0.7% NaCl,0.1%K2HPO4,0.02% NaH2PO4,pH 7.2～7.4,蒸馏水配制。
1.1.2.2　球孢链霉菌S186培养基
　　种子培养基:1%葡萄糖,0.4%蛋白胨,0.4%酵母膏,0.05% MgSO4*7H2O,0.2% KH2PO4,0.4% K2HPO4,pH 7.5,蒸馏水配制。
　　发酵培养基:2%糊精,0.4%大豆蛋白胨,0.2%蛋白胨,0.7% NaCl,0.05% KH2PO4,0.1% Na2HPO4,0.01% CaCl2,pH 7.5。
1.1.3　主要仪器
　　离心机:北京医用离心机厂;
　　旋转式摇瓶机:山东大学科教仪器厂；
　　pH S-4型智能酸度计:江苏电分析仪器厂；
　　722型分光光度计:上海第三分析仪器厂。
1.2　方法
1.2.1　酶作用底物(变形链球菌)的收集
　　变形链球菌37℃静置培养48 h,5 000 r/min离心20 min,蒸馏水洗2次,再用pH 5.6,0.05 mol/L磷酸缓冲液悬浮至OD580为0.8左右,冷藏备用。
1.2.2　酶活性的测定方法
　　粗酶液的提取:将球孢链霉菌S186的孢子悬浮液接入种子培养基,30℃,200 r/min振荡培养24 h,再以10%的接种量接入发酵培养基中，同样条件下培养96 h,过滤离心去沉淀,所得上清液即为粗酶液。
　　将0.05 ml备用变形链球菌菌悬液及1 ml适当稀释的粗酶液加入5 ml pH 5.6 醋酸-醋酸钠缓冲液中,55℃保温10 min,测定10 min前后的OD580值,每分钟使反应液浊度降低0.001个OD580值单位的酶量定义为一个酶活单位。
　　酶活(u/ml)=(OD0'-OD10')1 000/10
1.2.3　菌体生物量的测定
　　定时取一定量的发酵液6 000 r/min离心20 min,用蒸馏水洗2次,取沉淀85℃烘干至恒重。
1.2.4　发酵液中还原糖及总糖含量的测定
1.2.4.1　还原糖的测定［10］
　　将发酵液离心，取0.1 ml上清液,加入1.9 ml蒸馏水,0.5 ml DNS试剂,沸水浴5 min,迅速冷却,加7.5 ml蒸馏水,于520 nm处测OD值。
1.2.4.2　总糖的测定
　　将发酵液离心，取2 ml上清液,加入1 ml 6 mol/L HCl水解1 h,加入碘-碘化钾溶液检查水解是否完全,加1滴酚酞指示剂,以5 mol/L NaOH中和至溶液呈微红色,定容至10 ml。取 0.2 ml加 1.8 ml蒸馏水。0.5 ml DNS试剂,于520 nm处测其OD值。
　　总糖%=(还原糖毫克数×稀释倍数/加样量)×100
1.2.5　pH的测定
　　pH S-4智能酸度计测pH的变化。

2　结果与讨论
2.1　最适碳氮比［11］的选择
　　据前期研究［2,3,9］结果,以糊精为主要碳源,大豆蛋白胨,多聚胨为主要氮源,进行三因素三水平的正交试验,以确定最适 C/N比，采用L9(34)正交实验表 。

表1　正交试验因素水平表

水平

因　　素

糊精(%)

大豆蛋白胨(%)

多聚胨(%)

1

2.5

0.3

0.15

2

2.0

0.4

0.20

3

1.5

0.5

0.25

表2　正交试验方案及结果分析表

试验号

因　　　素

酶活(u/ml)

糊 精(%)

大豆蛋白胨(%)

多聚胨(%)

1

1

2.5

1

0.3

1

0.15

5.8

2

1

2.5

2

0.4

2

0.20

8.8

3

1

2.5

3

0.5

3

0.25

5.1

4

2

2.0

1

0.3

2

0.20

6.0

5

2

2.0

2

0.4

3

0.25

7.7

6

2

2.0

3

0.5

1

0.15

7.0

7

3

1.5

1

0.3

3

0.25

8.8

8

3

1.5

2

0.4

1

0.15

7.1

9

3

1.5

3

0.5

2

0.20

9.0

对照

2

2.0

2

0.4

2

0.20

7.0

K1(1水平产量和)

19.4

20.3

19.6

　　　续表2

试验号

因　　　素

酶活(u/ml)

糊 精(%)

大豆蛋白胨(%)

多聚胨(%)

K2(2水平产量和)

20.7

23.6

23.8

K3(3水平产量和)

24.9

21.1

21.6

k1(=K1/3)

　 6.46　

　 6.76　

　 6.56　

k2(=K2/3)

　 6.90　

　 7.86　

　 7.92　

k3(=K3/3)

　 8.30　

　 7.20　

　　从表中极差分析可见,各因素对产酶影响顺序为:糊精＞多聚胨＞大豆蛋白胨。其最佳配方为A3B2C2,从而确定最适培养基组成为:糊精1.5%,大豆蛋白胨0.4%,多聚胨0.2%。经验证,采用此配方酶活达到9.2 u/ml,经换算最适C/N为13∶1。
2.2　表面活性剂对产酶的影响
　　按不同比例 (0.1%、0.2%、0.3%)添加不同的表面活性剂(Tween20、Tween80、Triton x-100、SDS、洗衣粉)于发酵培养基中,30℃ 150 r/min培养96 h,测其酶活,结果如表3所示。

表3　表面活性剂对产酶的影响*

表面活性剂浓度(%)

Tween 20

Tween 80

Triton x-100

SDS

洗衣粉

0.1

230

160

50

70

110

0.2

190

150

-

80

100

0.3

　 90　

120

-

30

　 60　

　　　* 表中数据为相对活力,对照为100。　　- 未测出酶活。
　　从表3可知,Tween 20和Tween 80 能促进酶的产生,其中以0.1%的Tween 20效果最好。表面活性剂提高胞外酶产量的机理尚不完全清楚，它们的主要作用可能是提高菌株细胞膜通透性, 改变脂类代谢以及促进酶的释放, 去除了由于酶的胞内积累而引起的反馈抑制或阻遏作用, 成为一个良性循环。而 Triton x-100、SDS、洗衣粉均有不同程度的抑制作用, 抑制作用强弱依次为: Triton x-100＞SDS＞洗衣粉, 且培养过程中发现菌体生长不好, 有异味产生。这几种表面活性剂对菌体生长有很大的抑制作用，以致影响酶的产生。
2.3　消泡剂对产酶的影响
　　在发酵罐中发酵12 h后菌体进入指数生长期,大量繁殖，使发酵液粘度增大，产生大量泡沫，为验证消泡剂的加入是否对酶的形成或分泌产生影响，考察了几种不同消泡剂对产酶的影响 (加入量均为0.1%)。从图1可见适量植物油 (花生油、豆油、棕榈油) 的加入对变溶菌素的产生都有促进作用，而泡敌则对产生变溶菌素有抑制作用，这一点具有重要的实际意义，泡敌虽然是发酵工业上一种常用的消泡剂，但它不宜作为变溶菌素发酵大生产时的消泡剂。泡敌是如何对变溶菌素的产生形成抑制的有待于进一步研究，因此消泡剂选用植物油，从经济角度考虑可用豆油。

图1　消泡剂对产酶的影响

2.4　不同诱导物对产酶的影响
2.4.1　不同肽聚糖类型的细胞壁对产酶的影响
　　据文献4和12，在培养基中预先加入S. mutans菌体细胞可以诱导酶的大量生成。为了验证是否只有某些类型的肽聚糖的细胞壁对产酶有促进作用，在培养基中加入不同的菌体细胞，加量为5 mg/ml。实验结果表明，E.coli和Micrococcus luteus的菌体细胞的诱导作用不如S.mutans和Staphylococcus aureus的菌体细胞强，其中加入S.mutans菌体细胞可提高酶活2.45倍,同时也伴随有大量的色素形成。结果如表4 。

表4　不同肽聚糖类型的细菌细胞壁对产酶的影响

细胞壁来源

酶活 (u/ml)

E.coli

　 6.3　

S.aureus

13.0

Micrococcus luteus

11.9

S.mutans

18.9

对照

　 5.5　

2.4.2　不同S.mutans菌体细胞浓度对产酶的影响 ［13］
　　灭菌前分别在20ml发酵培养基中加入0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4ml (580nm OD值为0.8的菌悬液）变形链球菌作诱导物。灭菌后接种球孢链霉菌S186,30℃ 150 r/min培养4 d,测其酶活，结果如表 5 所示。

表5　不同S.mutans细胞浓度对产酶的影响

诱导物添加量(ml)

酶活(u/ml)

0.10

14.3

0.15

19.6

0.20

19.6

0.25

18.4

0.30

16.2

0.35

14.8

0.40

12.0

　　由表5可知,加入S.mutans菌体细胞作诱导物能促进酶的产生,其中以加0.15 ml/20 ml、0.2 ml/20 ml (580 nm OD值为0.8的菌悬液）效果最好。其原因有待于进一步研究。同时通过对整个发酵过程研究发现，S.mutans菌体的加入不仅使酶活性成倍地提高，也使菌体量大幅度增加，结果如图2、3所示，这也进一步说明菌体量的增大有利于变溶菌素的产生，二者之间有着比较密切的关系。

图2　S.mutans菌体细胞对变溶菌素产量的影响

●:有菌体细胞;　　▲：无菌体细胞

图3　S.mutans 菌体细胞对球孢链霉菌S186
生长的影响

●:有菌体细胞;　　▲：无菌体细胞

2.5　发酵时间对产酶的影响
　　将整个发酵时间延长，其结果如图4所示。从中可以看出, 96～100 h酶活最高，随着发酵时间的延长, 酶产量大幅度下降。所以一般到100 h时，应终止发酵。

图4　发酵时间对产酶的影响

2.6　不同种龄对产酶的影响
　　将S186菌从斜面接入种子培养基中，30℃培养不同时间(12、24、36、48、60、72 h),然后将不同种龄的菌种接入发酵培养基中，接种量为10%，30℃,150 r/min摇床培养96 h测酶活。结果如表6所示,种龄在24 h为最佳。

表6　不同种龄对产酶的影响

种龄(h)

酶活(u/ml)

12

4.3

24

9.0

36

6.5

48

5.4

60

5.0

72

3.8