黑暗链霉菌Ｆ-211经深层发酵产生暗霉素[1]。暗霉素由很多组分组成[2],其中主要组分为阿泊拉霉素,6″-Ｏ-氨甲酰卡那霉素Ｂ和6″-Ｏ-氨甲酰妥布霉素。6″-Ｏ-氨甲酰妥布霉素经酸或碱催化水解后即为妥布霉素[3]。妥布霉素属氨基糖苷类抗生素,已在临床上广泛使用。在低浓度下,能抑制革兰氏阴性菌的生长,它有很强的抗绿脓杆菌作用,比其它氨基糖苷类抗生素强28倍[4]。暗霉素发现于70年代,但我国直到90年代,才进入小规模工业化生产,且生产水平提高缓慢,发酵水平波动大,为了提高发酵生产水平,完善发酵工艺控制,本文有针对性地对发酵生产的培养基进行了筛选,并对影响发酵单位的关键参数进行探讨,找出影响发酵水平的主要因素,并提出控制方法,取得了良好的效果。从研究结果导出了合理的暗霉素发酵代谢曲线图。
1 材料和方法
1.1 材料和仪器菌种:黑暗链霉菌Ｆ-211。妥布霉素标准品和生测培养基:中国药品生物制品检定所。
培养基:工业化生产上使用的。
摇瓶机:220ｒ/ｍｉｎ。台式离心机:80 2,4000ｒ/ｍｉｎ,20ＭＬ×12。
发酵罐:2000Ｌ,180ｒ/ｍｉｎ。
1.2 分析方法
发酵单位:生物检定法[5]。
菌丝浓度:取发酵液10ｍｌ,于2500ｒ/ｍｉｎ下离心3ｍｉｎ,去上清液后的固体物作为相对菌丝浓度。
其它项目:总糖、还原糖、氨基氮、温度、ｐＨ等均采用工业化常规分析法[6]。
2 结 果
2.1 培养基成分的确定[7]
2.1.1 培养基中营养成分对暗霉素发酵单位的影响
用Ｌ27(313)正交表[8]对已筛选的常用13种培养基成分;葡萄糖,玉米淀粉,玉米粉,黄豆粉,硫酸锌,硫酸镁,鱼粉,硫酸铵,碳酸钙,蚕蛹粉,豆油,谷氨酸钠,淀粉酶的3个水平进行考察,每个500ｍｌ三角瓶装60ｍｌ,结果见表1。它们对暗霉素发酵单位影响从大到小依次为:硫酸铵,玉米粉,硫酸镁,玉米淀粉,豆油,碳酸钙,黄豆粉,葡萄糖,硫酸锌,蚕蛹粉,鱼粉,谷氨酸钠,淀粉酶。将蚕蛹粉,鱼粉,谷氨酸钠三个影响小的成分去除,但保留淀粉酶。去除简化后的培养基组成,经反复试验,对暗霉素发酵单位没有影响,因此最后培养基组成确定为(%):葡萄糖1.5;玉米粉2.0;硫酸镁0.5;玉米淀粉2.0;豆油1.1;碳酸钙0.7;黄豆粉3.5;硫酸锌0.01;硫酸铵0.7;淀粉酶0.025。
2.1.2 培养基中外加金属离子对暗霉素发酵单位的影响[9]
用以上确定了的培养基[2.1.1],再用Ｌ9(34)正交试验,增加对硫酸镁,硫酸锌,硫酸亚铁,硫酸锰的三个水平对发酵单位的影响,主要考察金属离子Ｍｇ+2、Ｚｎ+2、Ｆｅ+2、Ｍｎ+2对暗霉素最终发酵单位的影响,条件同表1,结果见表2。从结果看,它们的影响从大到小的次序为:镁;锌;锰;铁。
2.2 发酵工艺的研究[10]
2.2.1 菌丝浓度与暗霉素发酵单位的影响 本试验在2000Ｌ发酵罐中进行,装料体积500Ｌ,培养温度37℃,发酵周期112ｈ,培养基组成[2.1.1]作为对照(ａ),为了得到不同浓度的菌丝,主要采用改变最易影响菌丝生长的黄豆饼粉的浓度来实现。为了得到较高浓度的菌丝,将黄豆饼粉配比提高到4.5(ｂ);为了获得较低浓度的菌丝,将黄豆粉的配比下降为1.5(ｃ),最后将菌丝浓度 发酵单位与时间的关系绘成图1。
2.2.2 空气流量与暗霉素发酵单位的关系
试验同样是在2000Ｌ发酵罐中进行,培养基组成采用[2.1.1]已确定的配方。以不同的空气流量来实现不同的菌丝浓度。分三组:
(1)为了达到高浓度的菌丝,采用恒定的高通气流量0.8(ｍ3/ｍ3·ｍｉｎ-1);
(2)为了达到低的菌丝浓度,采用恒定的低通气流量0.1(ｍ3/ｍ3·ｍｉｎ 1);
(3)视菌丝浓度的变化调整不同的通气流量(见图2),最后将空气流量-菌丝浓度-发酵单位与时间的关系绘成图2,多次试验重复性良好。
2.2.3 搅拌对黑暗链霉菌孢子发芽的影响
本试验在1ｍ3发酵罐中进行,装料300Ｌ,搅拌转速150ｒ/ｍｉｎ,培养基组成为(%):葡萄糖0.5;玉米淀粉1.0;黄豆饼粉1.0;硫酸镁0.5;磷酸二氢钾0.05;碳酸钙0.1。分三组进行,实验安排与结果见表3。
2.2.4 不搅拌对暗霉素发酵单位的影响
本试验在2000Ｌ发酵罐中进行,装料量800Ｌ,培养基按[2.1.1]确定的配方。全程空气流量0.5ｍ3/ｍ3·ｍｉｎ 1,其余条件与正常生产一致,但不搅拌,结果发酵112ｈ后,暗霉素发酵单位仅192μｇ/ｍｌ,且得到反复证明。
2.2.5 黑暗链霉菌Ｆ-211发酵代谢控制图
根据正交试验确定的培养基配方[2.1.1],结合菌丝浓度、空气流量与发酵单位对时间的关系,对发酵代谢进行调节,得到了比较完善的发酵代谢调节控制图,总糖、还原糖、氨基氮等均在代谢图上反映。见图3。本代谢控制图已应用于生产,经正交试验,确立了合理的配方,加上关键工艺控制点的完善,使暗霉素的发酵单位从原来的1800ｕ/ｍｌ上升到了3800ｕ/ｍｌ,取得了明显的实际应用效果。
2.3 结果讨论
1)从Ｌ27(313)正交试验的结果可以看出,培养基搭配适当与否,极大地影响暗霉素的生物合成。最高发酵单位3753μｇ/ｍｌ,最低仅910μｇ/ｍｌ。通过实验,确定了较为合理的培养基配比[2.1.1]。去除了影响较小的成分,使配方趋于合理化。
2)为了验证金属离子在本发酵条件下的影响程度,选用了已报道[6]的对暗霉素合成影响较大的四种金属离子镁、锌、铁、锰,采用Ｌ9(34)正交表进行考察,结果与Ｌ27(313)正交表所得的实验结果相吻合,镁离子作用最显著,铁、锰离子的作用比锌的作用还要弱。所以铁锰不列作培养基成分(这个结果与报道的相反,主要原因是前人所做的试验是用合成培养基,而本试验是用与生产相一致的天然培养基)。其组成中的玉米粉、黄豆饼粉等已具备了足够的金属离子等微量元素。
3)采用改变培养基中的黄豆饼粉含量等获得了不同菌丝浓度对发酵单位的影响,从结果可以看出,菌丝浓度过高过低对提高发酵水平均不利,且过高比过低更不利。菌丝浓度过高,可能是菌体代谢没有及时地转向合成暗霉素,导致菌体猛长,结果发酵单位低;菌体浓度低单位反而好些,可能是菌体代谢已转向合成目标产物。因此存在合适菌丝浓度问题。
4)当以变化的空气流量进行培养,以控制空气流量来达到控制菌体浓度时,得到发酵单位始终是最高的。所以菌体浓度是影响暗霉素发酵单位的关键因素。通过改变空气流量来实现控制菌体浓度,是工业化中最方便、最简捷的办法,也是暗霉素发酵生产的显著特征。通气控制变化曲线见图3。
5)经综合各试验结果,绘制了合理的暗霉素发酵代谢控制图3。
6)由于目标产物6″-Ｏ-氨甲酰妥布霉素含ＣＯＮＨ2基团,从生化原理上讲,应该类似于尿素(ＮＨ2ＣＯＮＨ2)合成,需要ＣＯ2和ＮＨ3的参与,氨来源于谷氨酰胺。因此发酵环境中应保持一定浓度的ＣＯ2,通气量过大,发酵液中的ＣＯ2被大量带走,从而影响了暗霉素合成所需要的基本组分ＣＯ2。还有通气量大,大量长菌丝,三羧酸循环不受限制,导致谷氨酰胺的合成受到削弱,从而导致菌体内ＮＨ3的供应受到限制,所以通气量不能过大,也不能过小。存在不同培养时间有不同的最适通气量的特性[11]。
7)用Ｌ27(3 13)正交实验法确定的[2.1.1]培养基是可行的。在用天然培养基培养黑暗链霉菌生产暗霉素时,无需再加锰、铁离子。
8)菌丝浓度对暗霉素发酵单位影响明显,过高过低的菌体浓度对提高暗霉素发酵单位均不利,适当的菌体浓度(38%～40%)对提高和稳定暗霉素发酵单位最有利,而采用改变空气流量能方便地将菌体浓度控制在合适的水平上,这是暗霉素发酵生产的显著特征。采用该方法进行发酵生产,不仅发酵单位提高,而且实践证明6″-Ｏ-氨甲酰妥布霉素的含量比例没有下降。
9)黑暗链霉菌的孢子发芽对机械剪切敏感,孢子接种培养种子,不必开机械搅拌,以空气搅拌就能得到良好的一级种子,这是其又一显著特征。
