西索米星(Ｓｉｓｏｍｉｃｉｎ,ＳＩＳＯ)为一新胺基糖苷类抗生素,具有广谱的抗菌作用,抗感染的临床疗效优于庆大霉素。以它为原料经化学方法进一步半合成的衍生物奈替米星(Ｎｅｔｌｉｍｉｃｉｎ.ＮＴＬ)更具有低毒高效的特性,因此ＳＩＳＯ的生产条件研究有重要的社会和经济效益。我们从无锡太湖地区的湖塘泥中分离到ＳＩＳＯ产生菌橄榄星孢小单孢菌Ｍ-41[1],经多年诱变育种,工业菌株产抗生素能力有了较大提高[2,3]。在此基础上,我们采用控制发酵过程中种子期菌丝的生长形态,培养基中有机氮源质量和磷酸盐含量、ｐＨ、温度、搅拌速度、通气质量等手段,摸索出发酵效价水平高,发酵液中组份含量好的生产工艺控制条件,使ＳＩＳＯ发酵已达到适应工业化生产水平。本文从优化控制发酵条件方面探讨了影响ＳＩＳＯ发酵效价水平的因素。
1 材料与方法
1.1 菌种:橄榄星孢小单孢菌无锡亚种Ｍ-41(Ｍ.ｏｌｉｖｏａｓｔｅｒｏｓｐｏｒａｓｕｂｓｐ.Ｗｕｘｉｃｕｓｉｓ)。该菌株由我所从分土筛选获得,本实验室保藏
。1.2 培养基
1.2.1 斜面培养基(%):
淀粉1.0,葡萄糖0.5,硝酸钾0.05,氯化钠0.5,碳酸钙0.1,琼脂2.0。消前ｐＨ7.0。
1.2.2 种子培养基(%):
淀粉1.0,黄豆饼粉1.5,葡萄糖0.1,蛋白胨0.1,碳酸钙0.2。消前ｐＨ7.5。
1.2.3 发酵培养基(%):
淀粉3.0,黄豆饼粉2.0,蛋白胨0.15,鱼粉0.12,磷酸氢二钾0.03,氯化钴0.001,碳酸钙0.25。消前ｐＨ7.5。
1.3 发酵培养条件
1.3.1 摇瓶培养:
250ｍｌ三角瓶装置30ｍｌ,旋转式摇床上培养,转速220ｒ/ｍｉｎ,培养温度34℃。
1.3.2 玻璃搅拌式反应器培养:
采用华东理式大学生化工程研究所的ＢＬＭＦ-1-5型恒化反应器测定搅拌速度对ＳＩＳＯ生成的影响。容积1Ｌ,装量系数0.6,培养温度34℃±0.5℃,通气量0.7Ｌ/ｍｉｎ左右,常压下发酵。
1.4 测定方法
1.4.1 发酵效价测定:
参照中国药典,应用抗生素微生物检定法测定发酵生物效价,试验菌为短小芽孢杆菌[ＣＭＣＣ(Ｂ)63202],利用抗生素在琼脂培养基内的扩散作用,采用量反应平行线原理的设计,比较标准品与供试品两者对接种的试验菌产生抑菌圈的大小,以测定西索米星发酵液效价[4]。
1.4.2 酸价值与过氧化值测定:用碱滴定和硫代硫酸钠滴定法[5]测定。
2 结果与讨论
2.1 母瓶移种菌丝形态对发酵效价影响
取生长丰满的新鲜斜面孢子,以挖块法接入母瓶,摇床培养不同时间后取样镜检,不同阶段菌丝生长形态划分为以下三类:Ⅰ级丛状,菌丝粗短,染色深而均匀;Ⅱ级菌丝:培养至12ｈ-20ｈ菌丝分枝增多,生成迅速形成大量短丛或疏松大丛;Ⅲ级菌丝:24ｈ后菌丝繁殖成网,菌丝细长,染色稍浅,外观种子液转稠。取不同生长期母瓶菌丝作种子,按10%接种量接入发酵摇瓶,培养120ｈ后放瓶,测定发酵液的生物效价。发现以Ⅱ级形态的母瓶菌丝移种发酵情况最好,发酵代谢正常,生物效价可达到545ｕ/ｍｌ,发酵液中ＳＩＳＯ组份含量合适。如以Ⅲ级菌丝作种子,发酵代谢加快,发酵液ｐＨ上升至7.0以上,后期发酵效价停滞,甚至下跌,可导致放瓶生物效价仅为以Ⅱ级菌丝作对照组的30%左右,见表1。在多级发酵的工业化生产中,严格保证种子的质量,注意种子菌丝形态变化,控制移种最适时间,以确保发酵获得预期的结果。
2.2 培养基中有机氮源的酸价对发酵影响
在ＳＩＳＯ发酵试验中,发现在培养基固定配比的情况下,作为有机氮源的黄豆饼粉,因产地、品种、批号及贮藏条件的不同,其酸价的差异较大,对菌种的生长和发酵效价有很大影响。取不同批号的黄豆饼粉以碱滴定法测定其酸价,并分组进行摇瓶发酵培养。从表2可见,随着酸价的升高,发酵效价下跌,Ｎｏ.4组的放瓶生物效价只有255ｕ/ｍｌ,仅为对照的47.6%。
在中试发酵罐批试验中,也出现同样现象,用酸价较高的一些黄豆饼粉投料后,在发酵过程中会抑制菌体生长,引起菌丝量的减少,发酵培养液变稀,后期ｐＨ值上升很快,超出了菌体生长和合成分泌抗生素的最适范围,而造成发酵效价水平下降。因此,在工业生产中控制培养基中有机氮源的质量十分重要,防止应用霉变及贮藏不妥或周期较长的造成酸价较高的原材料,以减少对ＳＩＳＯ发酵有害因素。菌丝:接种后8ｈ-10ｈ孢子萌发成束状或短
2.3 磷酸盐对发酵的影响
取母瓶一级菌丝,按10%接种量移入含有不同浓度磷酸盐的发酵摇瓶中培养120ｈ测定发酵液生物效价。发现随着培养基中磷酸盐浓度的增加,发酵效价有所提高。当浓度为0.03%时,发酵效价可达到552ｕ/ｍｌ,但当磷酸盐浓度超过合适的范围达到0.05%或更多时,则造成发酵效价下降(表3)。
磷酸盐不仅是菌体生长的主要限制性营养成份,还是调节抗生素生物合成的重要参数。高浓度磷酸盐能阻遏一些抗生素合成酶的基因表达[6,7]。如用量不够,则往往不能满足菌体生长需要,影响糖酵解,造成代谢缓慢。因而,用量过多或过少都会对抗生素生物合成产生不利影响。对于生产来说,采用0.03%磷酸盐量使ＳＩＳＯ发酵正常进行。
2.4 ｐＨ值对ＳＩＳＯ发酵的影响(图1):
在ｐＨ值为6.4-7.0时,ＳＩＳＯ产量达到最大,ｐＨ值过高或过低都对ＳＩＳＯ正常发酵造成不利,尤其当ｐＨ上升时,会产生代谢异常,合成抗生素的酶活力受到影响,导致发酵效价明显下降。
2.5 温度对发酵效价影响:
图2显示了在一定条件下温度对橄榄星孢小单孢菌发酵生成ＳＩＳＯ产量的影响。从图2中的曲线可以看出,当温度低于30℃时,由于菌体的生长受到影响,使发酵代谢缓慢,ＳＩＳＯ产量不高。随着温度的升高,并在33℃-35℃时可以达到一个较高发酵效价平台,此时发酵代谢旺盛,合成抗生素的酶活力最强,但当温度继续升高时。则导致ＳＩＳＯ产量下降。因此,在工业生产中较好的温度应该控制在34℃±0.5℃。
2.6 搅拌速度对发酵效价影响:
在1Ｌ发酵反应器中,于一定通气条件下,发酵培养温度控制在34℃,ｐＨ值控制在6.7,不同的搅拌速度对ＳＩＳＯ发酵效价影响见图3,当搅拌速度在500ｒ/ｍｉｎ-700ｒ/ｍｉｎ时,能保证ＳＩＳＯ正常发酵时溶氧和传质的要求,发酵效价较高,搅拌速度过低或过高都会对ＳＩＳＯ的发酵带来不利影响。ＳＩＳＯ发酵属需氧发酵,所以氧的传递与摄取与抗生素生物合成有十分密切的关系。搅拌转速太低,由于气液交换不够,会影响培养液中溶氧浓度,如低于临界溶氧浓度,则难以满足菌体正常发酵对溶氧的要求。当搅拌速度过高时,培养细胞会受到机械损伤,尤其在发酵前期菌丝菌龄较短,菌体受到搅拌叶剪切力的影响,造成菌丝断裂,菌的形态发生变化,这不仅改变了培养液的流变学特性,而且会引起菌体低分子核酸类物质漏失和带有抗生素生物合成基因的质料的流失,导致抗生素生物合成能力的下降[8]。在工业生产中相应采用弯叶形中速搅拌能满足ＳＩＳＯ正常发酵要求。
2.7 空气质量对ＳＩＳＯ发酵影响:
在ＳＩＳＯ发酵过程中,就空气质量而言,除了为防止污染而需空气无菌外,还对压缩空气中含油量有严格的要求。非无油润滑的往复式空压机压缩的空气中带有一定量的油雾,含油量可在250ｐｐｍ以上,空气预处理系统并不能除尽这些油滴,细微的油雾气粒子能通过过滤介质进入发酵培养液中,对菌体产生毒害,抑制菌体生长,使菌丝产生自溶,造成发酵异常,效价下降,取工厂空压机出口经油水分离器流出的油滴,以1%量加入摇瓶培养基中,镜检观察到菌丝体生长被严重抑制,测定这些因空气压缩过程中产生高温而后被带出润滑油油滴的过氧化值,可达0.15以上,是正常值的数倍,由此可见,油经高温可能裂解产生的过氧化物之类有害物质是抑制菌体生长的重要因素,因此,为保证ＳＩＳＯ发酵正常,在工业化生产中需使用无油压缩机提供空气。
3 小结
根据以上实验结果,西索米星发酵工艺的优化控制条件可确定为:在固定培养基配比的情况下,选用酸价值低的优质黄豆饼粉作为氮源培养基之一,保持磷酸盐浓度在0.03%,用母瓶Ⅱ级菌丝作为种子,控制发酵ｐＨ值在6.4-7.0,温度34℃时,在搅拌速度为600ｒ/ｍｉｎ的1Ｌ发酵反应器中或摇床转速为220ｒ/ｍｉｎ的摇瓶中,西索米星的发酵效价可达到545ｕ/ｍｌ左右,在满足上述优化控制条件工业化生产中,同时必须相应注意通气质量,选用无油压缩机提供空气,西索米星的发酵效价也可达到此水平。
