自1980年青霉素半连续发酵工艺研究成功，使青霉素生产获得质的飞跃。因头孢菌素产生菌种子周期长达172小时，而发酵周期只有126±4小时，并且发酵第一阶段，即菌体形成产抗期时间长(约40±5小时)，再受补料量的限制，致使头C发酵工艺发展缓慢。目前，国内外头C生产一直采取补料分批发酵法，迄今为止，关于头C半连续发酵工艺的研究，在国内外还尚未见报道，本文参照皮尔特(Pirt)的理论，在有限的发酵周期内，结合头C生产经验，对头孢菌素C半连续发酵工艺进行了研究，通过改进现行补料工艺，采用补料并定时放料分批发酵(即半连续发酵)，提高了头C的生产速率，使发酵指数和罐批产量有了较大幅度的提高，收到理想效果。
一、材料和方法
1、菌种。顶头孢霉HC－98－1菌株系河北中润公司101车间头C生产菌株。
2、培养基
（1）种子培养基：玉米浆、蔗糖、葡萄糖、DL－蛋氨酸、豆油、CaCO3，pH：6.5－6.6。
（2）发酵培养基：玉米浆、淀粉、糊精、蛋氨酸、葡萄糖、油、CaCO3、MgSO4、(NH4)2SO4、FeSO4、MnSO4、ZnSO4、CuSO4，pH：6.0－6.1。
3、实验方法
（1）降低补料浓度，增大补料量，提高放罐体积。
（2）在发酵过程中，不断补料的同时，每隔一定时间取出一定体积的发酵液。
（3）头孢菌素C含量用HPLC测定，其色谱条件为：色谱柱为C18，4.6×25mm；流动相为乙腈：乙酸钠缓冲液(1:50)，进样量20μl，流速：2.0ml/min，检测波长：254nm。
二、分析结果与讨论
1、改变补料浓度与头C产量的关系
罐批产量 Pc=V放×μ效价
要追求Pc最大化,必须提高放罐体积和发酵单位,放罐体积
Vw=V初＋V补＋V代谢－V蒸发－V取样……A
V初：接后体积
V补：补加油硫铵和氨水体积
V代谢：菌体对基质氧化及产物合成产生的水
V取样：在整个发酵过程中所取的无菌样和测生化样
V蒸发：空气通过发酵液带走的水
其计算公式如下：
We=ρQ×（P－Pw）/P×(Xout－Xin)×T……B
ρ：空气密度(T/M3)
Q：通气量(M3/h)
P：标准大气压
Pw：空气中所含水蒸汽分压
Xout：排气中的湿含量
Xin：对应于Pw的湿含量
T：发酵时间
由上式可见，蒸发量与通气量成正比，与空气密度成正比，与空气湿度成反比，所以蒸发量受季节影响较大，这就要求我们设法改进空气分布，提高溶氧，降低通气量，减少蒸发量。
由蒸发量计算公式和头C生产统计加料量与放罐体积之间的关系找出全年各月份实际蒸发率实验值见表一。不同月份蒸发量与放罐体积对照结果见表二。
表二的放罐体积看到不同季节蒸发量对放罐体积有较大的影响。
增大放罐体积的另一主要途径就量增大补料体积，在头C发酵过程中
V补料=V油＋V氨水＋V硫铵……C
油在头C发酵过程中供能源、菌体碳骨架和参于合成头C分子，它经生化反应产生的水才能增大体积，氨水浓度固定不变只起调PH值，加量较小，硫铵为菌体提供硫原子和氮源，上述三者参加生化反应的综合式为：
C57H104O6＋NH3＋H2SO4＋O2
→C12H21O8N3S＋CO2↑＋H2O
由上式可知头C产量与油和硫铵加量正比的，为此我们结合对C式分析结果把硫铵浓度由原来的22±l％降到13±0.5％其结果如表三。
由表三看到降低硫铵浓度后，放罐体积在同月份情况下，可增大2.35m3，即提高5.17％，从而使罐批产量比原来提高6.63％。
2、定时放料与头C产量的关系
由于硫铵浓度的下降，增大了加料体积，随着发酵时间的延长，发酵罐中发酵液体积和菌丝浓度不断增大，使溶氧不断下降，同时造成罐压升高，空气流量下降，从而打破菌体维持产物合成的平衡，要使菌体处于较高的生产速率，必须使罐内有效体积，菌体生长速率、氧的供需不断地建立一种近似原来的平衡状态，即在不断补料的同时，定时放料，下面是不同时间点带放其罐批产量情况与分批发酵生产情况如表四、表五所示。
由表四的结果表明，以第三组试验方法产量最高，因为大罐接后体积为42.5～43m3，前期补料较少，设定蒸发量在整个发酵过程中恒定不变，到65小时V补≈V蒸发，而效价以恒定的生产速率增长是从75小时开始，可持续到110小时，此时发酵体积为43.5～46.5m3，并且罐内有效体积在44～45m3时，单位增长最快，由于人为降低硫铵浓度，增大补料量，94小时罐内体积已达到46m3以上，单位达到13000～14000u/ml，为使其以恒定生产速率生长，必须使罐内体积恢复到44.5m3左右，故94小时带放最佳，这与表四试验结果相一致。
由表五结果可见，通过半连续发酵，菌体的平均生产速率比一般的补料分批发酵提高9.45％，从而使罐批产量增大，主要是由于中间带放使菌体代谢尽可能处于原有的平衡状态，同时增加了稀释的承受能力，使菌体比生产速率增加，相应地增加了比生产速率及生产速率。
3、在半连续发酵中补料与带放量的关系
因空气湿度受季节影响导致蒸发量相差较大，为确保全年各月份产量均衡，首先保证放罐体积相同即保证带放体积相等。
V带放=(V油＋VNS＋V氨水＋V代)×(1－η)……D
η：蒸发率
无论在那个季节油及氨水浓度不变，菌体合成代谢形成的水不变，那么各月份的加油量、氨水和代谢水可近似相等，设这常数为Vk，则不同月份每批硫铵加量为：
VNS=〖V带－VK（1－η）〗/（1－η）
如果各月份每批带放相同的体积，则根据各月份的蒸发率来调整硫铵的浓度即可。
4、半连续发酵对头C发酵液质量的影响
由表六结果表明，半连续发酵DCPC/CPC杂质含量，较批发酵下降了10.54％，这是由于：
1批发酵到90小时后因体积增大，为防止逃液，被迫升高罐压，降低空气流量，造成气泡体积减小，从而缩小了气泡与液体的接触面积，不利于氧的传递，通过带放使罐压和通气量恢复原来状态，增大氧传递速度。
2因批发酵后期液面高，增大加油率，结果不仅增大发酵液表观粘度，使通气效率下降，而且，过多的油会聚集在菌体表面，减少气泡与菌体的接触面积，降低氧传递速率，因油具消泡作用，故减少气—液界面以及气—液接触时间，从而降低通气效率，通过带放降低了罐内体积和罐压，加油率下降，铲除上述因素导致氧的利用率下降。
3在批发酵后期，由于氧传递受阻，造成菌体内部合成产物的氧比消耗速率Q02P 半连续发酵在头C发酵生产中的应用，打破了国内外传统的单批发酵，不仅增大了罐批产量，提高了发酵指数和发酵液质量，同时还可延长发酵周期，提高设备利用率，使发酵成本下降，至于在补料过程中，加料稀释率ω多大时，带放次数多少，每次带放体积多大，使罐批产量最大，还需进一步研究。(文/付海云 王红权 王俊刚)
