通讯作者> 胡海峰:研究员,博士,上海医药工业研究院生物
肿瘤仍是当今世界危及人类生命的一种最常见、最严重的疾病。WHO预计,到2020年,世界年新增肿瘤患者将达到2000万人[1]"近几年来,肿瘤化疗取得了相当的进步,肿瘤患者生存时间明显延长,特别是对白血病!恶性淋巴瘤等的治疗有了突破,但对危害人类生命健康最严重的实体瘤的治疗未能达到满意的效果[2]"随着科技的发展,研究抗肿瘤药物的方法和手段也越来越先进,如新的抗肿瘤定靶筛选模型和高通量筛选,推动了抗肿瘤新药的发展"
本实验室利用肿瘤细胞筛选模型先后筛选了多株具有抗肿瘤活性的菌株,从其中一株链霉菌SIPI-100中发现了有免疫抑制活性的化合物SIPI-100-1[5]"本文描述从链霉菌SIPI2100发酵液中分离出的抗肿瘤活性化合物SIPI-100-2,主要报道其发酵、提取、纯化和结构鉴定以及其生物学活性"
1 仪器与材料
熔点用YanacoKoffler熔点测定仪测定(未校定);核磁共振图谱用Varian2Inova2400型核磁共振仪测定;红外光谱用PE2683红外分光光谱仪;紫外光谱用Unikon930Spectrophotometer;HPLC为Wa2ters公司的510泵和PDA检测器"菌株是从云南大理土壤中分离出的链霉菌,命名为SIPI-100"柱层析及薄层层析用硅胶为青岛海洋化工厂生产,所用试剂为分析纯"K562、A549、LOVO等细胞模型为上海医药工业研究院药理实验室提供"
2 方法与结果
2.1 发 酵
SIPI-100的发酵采用二级发酵,首先将菌株转接于高氏一号斜面培养基(组成:可溶性淀粉20g,NaCl 0.5g,KNO3 1g,FeSO4#7H2O 0.01g,K2HPO4#3H2O 0.5g,MgSO4#7H2O 0.5g,琼脂20g,蒸馏水1000mL,pH7.2~7.4)上,28度培养7d后接种于种子培养基(组成:麦芽糖2.5g,黄豆粉1g,酵母粉0.35g,KCl 0.4g,(NH4)2SO4 0.5g,CaCO3 0.3g,K2HPO4#3H2O 0.01g,蒸馏水1000mL,pH7.2),30度培养48h,转种于发酵培养基(同种子培养基)30度培养3d"
2.2 分离纯化
菌株SIPI-100的发酵液经离心,去除菌丝体,加入等体积的乙酸乙酯提取2次;乙酸乙酯萃取液经蒸馏水洗涤、无水硫酸钠干燥!过滤,减压浓缩至浆状物"浆状物用氯仿溶解,拌硅胶(300~400目),晾干,上硅胶柱分离,用氯仿和甲醇系统梯度洗脱,比例依次为氯仿-甲醇(100:2、100:5、100:8、100:9、100:10、100:15、100:20,V/V),TLC检测"TLC展开系统为氯仿:甲醇(10:1.2,V/V),紫外下观察"经一次硅胶柱分离得到紫色化合物粗品,粗品再用硅胶柱分离,并且在氯仿中重结晶,得SIPI-100-2化合物纯品;HPLC分析,纯度达98%以上"
2.3 SIPI-100-2的理化性质
化合物SIPI210022为紫色粉末,易溶于甲醇!丙酮,溶于氯仿,二氯甲烷等有机溶剂,微溶于水"遇到酸、碱、热时不稳定,见光易分解;干燥时比较稳定"其理化性质见表1"
2.4 结构解析
SIPI210022化合物的EI-MS图谱中无明显的分子离子峰,据ESI2MS图谱分析,发现545(M+2H)峰和569(M++Na)峰,确定其分子量为546"紫外光谱中出现234nm和324nm两个最大吸收峰,表明结构中存在2个双键以上的共轭系统"
1HNMR(400MHz,CDCl3)中比较明显的烯氢质子有61997(1H,s),61973(1H,s),61562(1H,t,J=29Hz),51798(1H,t,J=27Hz),51543(1H,d,J=12Hz),41909(1H,s)和31337(1H,d,J=11Hz),另外91172(1H,s)和61284(2H,s)分别为-OH和-NH2中活泼质子峰;图谱中出现2个甲氧基峰(31306)和4个甲基峰,其中2个甲基与-CH-相连,2个甲基与-C=相连"
13CNMR(400MHz,CDCl3)图谱中出现28个碳原子峰,含有2个甲氧基碳561033和561437,4个甲基碳121068,121323,121938和221953,以及其他22个其他类型碳原子"根据文献报道[3,4],化合物SIPI-100-2与geldanamycin结构类似,但分子量相差14,推测其结构应该为17-O-脱甲基gel2danamycin,碳谱数据比较及其他数据分析,证实两者一致性,结构见图1,两个化合物的碳化学位移比较见表2"
2.5 生物学活性
以不同肿瘤细胞为实验模型,用MTT方法检测化合物SIPI-100-2的抗肿瘤作用,在多个细胞模型中均检测到该化合物的抗肿瘤活性"其中,SIPI-100-2对人白血病细胞(K562)模型作用最为显著,其IC50为18.52ug/mL-1.此外SIPI-100-2对人肺腺癌(A549)!、人体肠癌(LOVO)等实验模型都有较好的抑制活性"
3 讨 论
微生物的次级代谢产物是发现与研制新药的丰富资源之一,多年来已从微生物代谢产物中发现为数众多的抗肿瘤活性物质"但就自然界存在的微生物种类而言,已研究开发的仅占很小一部分"近年来在微生物分离、鉴定、培养等方面技术的进展将可能对更多种属的微生物及其代谢产物进行筛选研究"对于已研究较多的链霉菌属,如果利用新的分子靶点与筛选模型,仍可能发现新的活性物质"本文介绍的SIPI-100-2化合物具有中等强度的抗肿瘤作用"
参考文献
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[3] 沈淑鹃(ShenSJ).波谱分析法[M].上海:华东化工学院出版社,19921
[4] DeboerC,MenulmanPA,WnukRJ,etal.Geldanamycin,anew
antibiotic[J].JAntibiot,1979,32(4):44224471
[5] 朱宝泉(ZhuBQ),胡海峰(HuHF),张 琴(ZhangQ),等.微生物来源免疫抑制活性化合物SIPI-100-1的研究[J].中国天然药物(ChinJNatMed),2003,1(1):542561
