海洋微生物具有生态和种群类型的多样性,独特的代谢方式,丰富多样的代谢产物"从海洋微生物的次级代谢产物中寻找开发具有药用价值,不同于陆栖微生物产生的生物活性物质,具有巨大的潜力和发展前景[1]"随着对海洋微生物中次级代谢产物研究的深入,许多结构新颖!活性独特的化合物被发现,其中有的具有很好的抗菌活性[2],引起了广泛关注"
本实验室对来自不同样品分离的海洋微生物代谢产物进行了抗菌及细胞毒性等生物活性的筛选,对筛选出的海洋放线菌M326的发酵产物进行了活性及理化特性的初步研究"
1 材料
1.1 海洋放线菌菌株
放线菌M326菌株是由本实验室分离的一株海洋放线菌,初步鉴定为链霉菌属(Streptomyces)"
1.2 供试菌株
供试菌株有敏感株:金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、绿脓杆菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌;耐药菌株:金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、大肠杆菌"所有菌株均由中国药科大学微生物教研室提供"
1.3 培养基
1.3.1 放线菌培养基
各放线菌培养基如下:
1号培养基(GPDA):葡萄糖1%;马铃薯10%;蛋白胨0.4%;2号培养基(GBP):葡萄糖1%;牛肉膏0.3%;蛋白胨0.5%;3号培养基(GYP):葡萄糖1%;蛋白胨0.4%;酵母粉0.1%;4号高氏培养基(GS)[3]
1.3.2 营养肉汤培养基(培养供试细菌用)[4]蛋白胨1%;牛肉浸膏0.3%;NaC10.5%;琼脂2%;pH7.0~7.4"
2 方法
2.1 不同培养基对菌体生长及产物活性的影响
分别用天然海水(NSW),人工海水(ASW)[5],蒸馏水(DW)配制1~4号培养基50mL(pH7.2),接入活化的菌种液1mL,在28度,200r*min-1下振荡培养至混浊时中止,观察发酵液颜色,测定发酵液的pH,3000r*min-1离心10min测定菌体湿重"发酵液4度,5000r*min-1离心10min,取上清液作为样品,以金黄色葡萄球菌为指示菌测定各样品的活性,实验方法同2.3,以下抑菌活性测定方法相同"
2.2 发酵时间对产物活性的影响
用人工海水配制GBP培养基400mL,灭菌后接入菌种液4mL,28度,200r*min-1振荡培养24h后每隔12h取样1次,每次10mL,4度,5000r*min-1离心10min,取上清液测定抑菌活性"
2.3 发酵液抗菌活性的测定
海洋放线菌M326用GBP2ASW培养基发酵,28度,200r#min振荡培养72h,发酵液4度,5000r*min-1离心10min,取上清液作为样品,采用琼脂打孔法[6]分别测定样品对各供试菌株的抑菌活性"即将麦氏度为0.5的指示菌液200uL均匀涂布于营养肉汤平皿上,用无菌打孔器在培养基上打孔,取样品液40uL于孔中,于37度培养箱中培养16h,测定抑菌圈直径"
2.4 活性物质对温度、pH值的稳定性
将预处理后的发酵液分别进行不同的pH、温度处理,测定各处理样品的抑菌活性"
2.5 活性物质的萃取试验
将预处理后的发酵浓液调pH为3,7,9,在各pH下分别用1：1的氯仿、醋酸乙酯、水饱和的正丁醇萃取,分别测定各样品的抑菌活性"
2.6 发酵液活性物质的提取
将发酵液调pH3.0,60度减压蒸干用甲醇多次充分浸提,抽滤后60度减压浓缩成膏状物,用适量水溶解抽滤,调pH8.0后用预处理(用乙醇浸泡洗涤,充分水洗)后的AB28大孔树脂吸附,先用蒸馏水洗涤至AgNO3检测无沉淀产生,再用甲醇:丙酮(1:1)洗脱,分部收集洗涤、洗脱液,测定不同洗涤、洗脱液样品的活性,将有活性的部分合并,减压浓缩成膏状物,即得活性物质的脱盐粗提物"
2.7 粗提物的薄层层析(TLC)
将粗提物溶于少量甲醇中,在GF254硅胶板上(20cm x15cm)点样,经筛选后选用甲醇:丙酮(6：4)为展开剂,展层后干燥,在245nm的紫外灯下观察,并用硫酸香草醛喷雾显色"
2.8 活性物质的溶解性
分别取初提物10mg溶于1mL醋酸乙酯、氯仿、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、二甲亚砜、无菌水中,充分振荡静置过夜,取15uL上清液于6mm无菌滤纸片上,待有机溶剂挥干后贴在含有指示菌的平板上,以对应的浸有有机溶剂的纸片吹干后作对照,测定各样品的活性"
3 结果
3.1 不同培养基对菌体生长及代谢产物抑
菌活性的影响不同培养基对放线菌M326生长及发酵液抑菌活性影响的结果见表1"不同培养基发酵液的颜色、菌体生长量、抑菌活性差异较大,GBP2ASW,GBP2ZLW培养基发酵液活性较强"天然海水、人工海水、蒸馏水对产物活性的影响与培养基的组成有关,如对于GBP培养基而言,ASW、ZLW是较好的基质,GPDA培养基而言NSW,ASW是较好的基质"
3.2 发酵时间对代谢产物抑菌活性的影响
海洋放线菌M326在用人工海水配制的GBP培养基中发酵,产物的活性随发酵时间的变化如图1所示:产物的活性在发酵48h后快速上升,78h左右可达到最大,然后有缓慢下降趋势"
发酵液对供试菌的抑菌活性如表2所示:发酵液对G+菌具有较强的抑菌活性,对G-!多种耐药菌均有不同程度的抑菌活性"发酵液中含有与青霉素!链霉素作用不同的活性物质"
3.3 发酵液的抑菌活性
3.4 温度、pH值对发酵液抑菌活性的稳定性
温度、pH值对海洋放线菌M326发酵产物活性的影响如表3、4、5所示:在pH>4时,对热不稳定,60度加热60min活性丧失44.4%,但在pH3.0时活性物质对热很稳定"在pH值2~11范围内对活性没有明显影响"
3.5 发酵液的萃取试验结果
萃取结果如表6所示:活性物质在酸、中、碱性条件下均不能被氯仿、醋酸乙酯萃取,在碱性条件下可被正丁醇部分萃取,这表明活性物质的极性较大,酸性条件下可能以盐的形式存在"
3.6 发酵液活性物质的提取
由于活性物质极性较大,一般有机溶剂难以萃取,采用发酵液减压蒸干后膏状物用甲醇多次浸提,基本上可将活性物质充分提取,在pH8.0下可被AB28大孔树脂吸附,水洗液无活性,可充分脱盐,甲醇:丙酮(1:1)洗脱活性物质集中"
3.7 初提物的溶解性结果
初提物在不同溶剂中的抑菌活性如表6所示:活性物质在低级醇及水中的溶解性好,难溶于低极性的有机溶剂,再次表明活性物质极性较大"
4 讨论
海洋放线菌M326在海水中生长良好,但产物的活性不及蒸馏水与人工海水,可能与海水中含有抑制活性产物形成的物质有关,此现象在别的文献中也有报道[7],本实验还发现天然海水对产物活性的影响还与培养基的组成有关"
已有的研究表明海洋微生物与陆生微生物一样,活性产物的生成受培养基的影响很大,而培养基的组成和发酵基质是影响活性的二个重要方面[8],对海洋放线菌M326发酵培养基的初步优化中也表现出这些特性,因此,在对海洋微生物进行活性产物的筛选时,选用合适的培养基是提高筛选率,防止漏筛的有效方法之一"
海洋放线菌M326的代谢产物具有很好的抗菌活性和较强的极性,目前,国内对于海洋微生物强极性活性产物的研究不多,该菌的活性产物有进一步研究的价值"
参考文献:
[1] 刘晓红,赵丽冰,佘志刚,等.海洋微生物活性代谢产物的研究进展[J].中国抗生素杂志,2004,29(8):419.
[2] 焦炳华,穆军,许强芝,等.海洋微生物来源新抗生素的研究[J].抗感染药学,2004,6(1):1.
[3] 林茂.海洋生物抗肿瘤活性物质组合筛选模型的建立与应用[D].广东:华南热带农业大学,2002.
[4] 马绪荣,苏德模.药品微生物学检验手册[M].第2版.北京:科学出版社,2000:20.
[5] 张士璀,范晓,马军英.海洋生物技术原理和应用[M].第1版.北京:海洋出版社,1998:13.
[6] BelofskyGN,AngueraM,JensenPR,etal.Oxepi2namidesA2CandfumiquinazolinesH2I:bioactivemetabo2litesfromamarineisolateofafungusofthegenusAcremo2nium[J].Chemistry,2000,6(8):1355.
[7] 罗文新,陈晓佳,黄耀坚,等.来自海洋的链霉菌抑菌活性与其培养条件的关系[J].微生物学通报,1998,25(6):325.
[8] 何培音,田黎,李光友,等.海洋细菌B29987发酵条件的优化及胞外抑菌物质的理化特性[J].中国海洋药物,2001,20(2):8.
(收稿日期:2005206213)
