多粘菌素Ｅ(ｃｏｌｉｓｔｉｎ)是由多粘类芽胞杆菌(Ｐａｅ ｎｉｂａｃｉｌｌｕｓｐｏｌｙｍｙｘａ)产生的一种碱性多肽类抗生素,对革兰氏阴性杆菌有强烈的杀菌作用[1,2],无论生长期还是静止期的细胞均能被很快杀死。它可以治疗由志贺氏痢疾杆菌(Ｓｈｉｇｅｌｌａｄｙｓｅｎｔｅｒｉａｅ)、大肠埃希氏菌(Ｅｓ ｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ)、铜绿假单脆菌(Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕ ｇｉ ｎｏｓａ)、沙门氏菌属(Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ)和普通变形杆菌(Ｐｒｏ ｔｅｕｓｖｕｌｇａｒｉｓ)引起的感染,并对霍乱弧菌(Ｖｉｂｒｉｏｃｈｏｌｅｒ ａｅ)、鼠疫杆菌等也有良好的作用。由于多粘菌素Ｅ具有较好抗菌谱和高效(大多数菌株最小抑菌浓度<6.25μｇ/ｍｌ)、低毒、残留少的特性,可用于饲料添加剂,促进禽畜生长和提高饲料利用率,并且可以防止饲料大规模生产中常出现的由大肠埃希氏菌和沙门氏菌污染引起的疾病。
诱变随机育种在菌种选育史上创造了辉煌的业绩,但却需要耗费大量的人力、物力,效率又不高。因此,本文在对多粘菌素Ｅ产生菌筛选过程中采用了诱变与定向筛选相结合的方式,即根据多粘菌素Ｅ生物合成途径的调控机制和本身的分子结构特点选用重金属离子和氨基酸结构类似物进行筛选,获得高产菌株。
1 材料和方法
1.1 出发菌株Ｐ.ｐｌｏｙｍｙｘａ18 3由本实验室提供。
1.2 培养基
1.2.1 完全培养基(ＣＭ) 蛋白胨10.0ｇ,牛肉膏3.0ｇ,葡萄糖5.0ｇ,ＮａＣｌ5.0ｇ,蒸馏水定容至1Ｌ,ｐＨ7.0。
1.2.2 基本培养基(ＭＭ) ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.25ｇ,ＫＨ2ＰＯ44.5ｇ,Ｋ2ＨＰＯ4·3Ｈ2Ｏ10.5ｇ,(ＮＨ4)2ＳＯ41.0ｇ,柠檬酸三钠1.0ｇ,葡萄糖1.0ｇ,蒸馏水定容至1Ｌ,ｐＨ7.0～7.2,灭菌后加入10μｇ/Ｌ的生物素。
1.2.3 发酵培养液 玉米浆0.03Ｌ,淀粉10.0ｇ,(ＮＨ4)2ＳＯ48.0ｇ,ＣａＣＯ310.0ｇ,蒸馏水定容至1Ｌ,ｐＨ7.0～7.2。
1.2.4 抗生素检定Ⅵ培养基[3] 蛋白胨8.0ｇ,牛肉膏3.0ｇ,葡萄糖2.5ｇ,酵母粉5.0ｇ,Ｋ2ＨＰＯ41.0ｇ,ＮａＣｌ4.5ｇ,琼脂20.0ｇ,蒸馏水定容至1Ｌ,ｐＨ7.0。
1.3 高产菌株的筛选
1.3.1 紫外线诱变处理
接种18 3号菌株到ＣＭ液体培养基中,连续活化2次后再培养至对数生产期,3000ｒ/ｍｉｎ离心5ｍｉｎ收集对数生产期菌体,菌液用ｐＨ6.0磷酸缓冲液洗涤离心2次,最后用生理盐水悬浮,用玻璃珠充分搅散,并使菌悬液ＯＤ600≈0.1。将制备好的菌液8ｍｌ于含磁针的平板中,紫外线照射(15Ｗ,30ｃｍ,237.5ｎｍ)30ｓ后,加入到含0.6ｍｇ/ｍｌＣｕ2+的ＣＭ液体培养基中30℃避光培养48ｈ后稀释涂布于ＣＭ平板,30℃培养24ｈ,挑取长出的单菌落进行摇瓶初筛、复筛,获得高产突变株。
1.3.2 ＮＴＧ诱变处理
取按1.3.1节获得的高产菌株斜面菌种接种到100ｍｌ液ＭＭ培养基中,28℃活化24ｈ。取0.1ｍｌ涂布于ＭＭ培养基平板上,用破口滴管取少许ＮＴＧ颗粒置于平板中央,30℃培养24ｈ后刮下透明圈周围的菌苔于含15ｍｇ/ｍｌα 氨基丁酸的液体ＭＭ中,28℃培养48ｈ后稀释涂布于ＭＭ平板上,30℃再培养48ｈ挑取长出的单胞进行摇瓶初筛、复筛、获得高产突变株。
1.4 发酵效价测定[3]
发酵液经12000ｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ取上清液以双碟扩散法测定发酵效价,指示菌为大肠埃希氏菌ＣＭＣＣ(Ｂ)44103。
2 结果
2.1 紫外线诱变剂量的考察
不同时间下,紫外线照射(15Ｗ,30ｃｍ,237.5ｎｍ)Ｐ.ｐｏｌｙｍｙｘａ18 3,根据菌体存活率和死亡率绘制的菌体对紫外线诱变的致死曲线(图略)可以看出Ｐ.ｐｏｌｙｍｙｘａ对紫外线非常敏感,在30ｓ时的死亡率接近100%,故在选择较高剂量的同时,为保证能获得足够的突变株进行进一步的筛选。选用30ｓ作为照射时间比较恰当。
2.2 重金属Ｃｕ2+用于筛选多粘菌素Ｅ高产菌株
2.2.1 Ｐ.ｐｏｌｙｍｙｘａ18 3菌株对重金属Ｃｕ2+的耐受浓度
当液体培养基中Ｃｕ2+浓度达到0.6ｍｇ/ｍｌ时就对菌体生长有了明显的抑制作用(表1)。可见,该浓度的Ｃｕ2+已影响了菌体的代谢过程,因此可以利用这个敏感浓度位点对菌体进行诱变后的筛选,以期得到高产多粘菌素Ｅ的突变株。
2.2.2 Ｃｕ2+作为选择因子筛选突变株
诱变后的菌悬液经Ｃｕ2+处理后挑取50个单胞上摇瓶发酵,经摇瓶初筛,只有5株单胞的发酵效价高于出发菌株18 3的发酵效价。将所得的5株菌再各分得4个单胞进行摇瓶复筛后获得9株比出发菌株多粘菌素Ｅ产量提高30%以上的高产菌株,产量提高百分率见图1。
2.3 ＮＴＧ诱变获得耐受高浓度ＤＬ α 氨基丁酸的突变株
以2.2节筛选得到的高产的菌株为出发菌株,用ＮＴＧ诱变,经α 氨基丁酸筛选后随机挑取60个菌株,摇瓶初筛后得到33株发酵效价比出发菌株高。将效价提高20%的菌株分离单胞,摇瓶复筛后获得6株发酵效价比出发菌株高且遗传稳定的菌株(表2),其中最高的43 2菌株多粘菌素Ｅ产量提高34%。
3 讨论
诱变育种方法简便有效,至今仍是工业微生物育种的重要手段,但一般都需要对很大数量的菌株进行筛选方能奏效。这种育种方式近来年在理论与技术上都有新的发展,但如何提高效率,减少盲目性,仍是当前的重要问题。在多粘菌素Ｅ高产菌株的筛选过程中,本实验试图采用传统的诱变育种与高效的推理选育方法相结合的方式。推理选育方法就是运用已知的生物化学与遗传学原理,根据已知或可能的抗生素生物合成途径的调控机制和产物的分子结构,设计出一些筛选方法,定向地选出某些类型的突变株[4]。就多粘菌素Ｅ生物合成和产物分子结构的特点,本文采用了重金属离子及氨基酸结构类似物两种推理选育方法。
培养基中二价金属离子,尤其是重金属离子达到一定浓度时大多数菌的生长被抑制,只有那些对该金离子具有抗性的菌株才能够生长。抗性的机理可能是菌体分泌某些次级代谢产物或中间体以及与其相关的酶结合该金属离子,形成无毒或低毒的复合物以解除金属离子对菌体本身生长的抑制作用[4]。本实验采用铜离子作为筛选因子,并取得了较好的实验效果,获得了一株产量提高45%且遗传稳定的正突变株。
每分子多粘菌素Ｅ内含6ｍｏｌα,γ 二氨基丁酸(Ｄａｂ),1ｍｏｌ6 甲基辛酸(ＭＯＡ)或异辛酸(ＩＯＡ)。ＭＯＡ,ＩＯＡ主要由丙酮酸族氨基酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ形成,比较产与不产多粘菌素Ｅ细胞内氨基酸含量,Ｖａｌ:2.66倍,Ｉｌｅ:5.05倍,Ａｌａ:3.28倍(产多粘菌素Ｅ细胞内含量/不产多粘菌素Ｅ细胞内含量)。同时,Ｖａｌ、Ｉｌｅ具有部分相同的代谢结构,细胞内过量的Ｖａｌ会反馈抑制Ｉｌｅ的产生。此外,α 氨基丁酸也是Ｄａｂ的结构类似物。因此,利用缬氨酸结构类似物进行抗代谢物筛选,解除合成ＭＯＡ(ＩＯＡ)、Ｄａｂ时的反馈抑制,进而解除合成多粘菌素Ｅ时的反馈抑制,极可能有效提高菌种合成多粘菌素Ｅ的能力[5,6]。实践证明该筛选方案对于筛选多粘菌素Ｅ高产菌株是行之有效的。
同时在研究中我们也发现不能用一种筛选方案重复使用,否则筛选效率会急剧下降,甚至不起作用,这可能与抗生素的生物合成受多基因调控有关。因此,在菌种选育过程中应交叉采用多种不同的筛选方案才能取得较好的结果。
参考文献略
