红霉素属于大环内脂类抗生素,由红色糖多孢菌产生,是继头孢菌素、青霉素后应用最广泛的抗生素,对革兰阳性菌、抗酸杆菌、立克次体及大病毒具有抗菌活性,是治疗耐药性金葡菌感染和溶血性链球菌感染所引起疾病的首选药物,临床上可用于对青霉素过敏的患者。近年来,红霉素衍生物如克拉霉素、阿齐霉素的兴起,更加剧了对母体红霉素的需求。
在提高红霉素效价的研究中,有机氮源是一个非常重要的方面。我们的研究表明以豆饼粉和酵母粉复合作为有机氮源能极大的促进红霉素的生物合成[1]。由于有机氮源是营养成分复杂的化合物,所以有必要深入分析有机氮源中影响发酵的具体因素。
本文在研究有机氮源对红色糖多孢菌H18红霉素生物合成的影响基础上,使用逐步回归的方法分析了不同有机氮源所含的营养成分,结果显示有机氮源中所含的苏氨酸是影响红霉素效价的主要因子。向对照培养基中添加苏氨酸,使红霉素的效价比对照培养基提高了22.85%。
1 材料与方法
1.1 菌株红色糖多孢菌H18(SaccharpolysporaerythreusH18)由本课题组自备。
1.2 培养基
种子培养基 淀粉3.5g,黄豆饼粉3.0g,葡萄糖0.5g,硫酸铵0.6g,碳酸钙0.5g,油0.1ml/50ml培养基,用水定容至100ml。
摇瓶培养基 淀粉4.5g,黄豆饼粉4.0g,硫酸铵0.8g,碳酸钙0.9g,油0.2ml/25ml培养基,用水定容至100ml。
1.3 培养方法
种子培养 培养基灭菌前pH调至7.0,将斜面孢子挖块接种在种子培养基,摇床220r/min,32℃培养42h。
摇瓶培养 培养基灭菌前pH调至6.8,将种子培养基以5%的接种量接种在摇瓶培养基,摇床220r/min,32℃培养6d。
1.4 分析方法
红霉素效价测定采用硫酸水解法进行。红霉素经硫酸水解后呈黄色,在483nm处有最大吸收值,可以定量测定。同时我们也测定红霉素的生物效价,因为红霉素存在组分的差异,生物效价测定的数据较化学效价低15%左右(数据未列出)。如果文章没有特别说明,数据为硫酸水解法测定的结果。
1.5 数据处理软件
MATHCAI应用数学方法软件包3.0版(C),华东理工大学数学系陆元鸿开发。
2 实验结果
2.1 红霉素效价对氮源的变化的响应
Singh[2]等发现使用不同氮源时红霉素的效价显著不同,并且花生粉作有机氮源时红霉素的效价最高。本文考察了氮源的变化对红霉素效价的影响,结果见图1。
从图1可以看出,A氮源使用4%的黄豆饼粉作为对照培养基时红霉素的效价为5221μg/ml;B氮源使用4%的棉籽饼粉时其效价为4178μg/ml,提示使用不同种类的氮源时红霉素的效价明显不同。同时C氮源使用3.5%的黄豆饼粉和0.5%啤酒酵母粉的效价为8018μg/ml,D氮源使用3%的黄豆饼粉和1%啤酒酵母粉的效价为9313μg/ml,提示虽然使用相同种类的氮源,但是氮源比例不同,那么红霉素的效价也明显不同。
2.2 不同氮源所具有的营养成分
红色糖多孢菌在摇瓶中如果氮源的种类或比例不同,红霉素的效价也明显不同。因此有必要知道不同氮源所具有的具体营养成分。工业发酵过程中常用的氮源多为农副产品,含有氨基酸类、维生素类、无机盐类等营养成分[3]。因本实验的摇瓶培养基另外添加硫酸铵和碳酸钙,并且对无机盐类及一些相关的微量元素进行过单独单因子实验,故在本次分析中不再考虑氮源中所含有的无机盐类营养成分。
根据不同氮源的营养成分对不同培养基中氮源组合的营养成分进行计算,结果如表1所示,同时对使用不同氮源培养基红霉素的效价也列在表1。
2.3 运用逐步回归的方法对营养成分进行分析
在多元线性回归问题中自变量的个数很多,多个自变量之间往往会产生线性相关或近似线性相关关系,这种相关关系称为"复共线性"。"复共线性"的存在使回归分析的误差增大,得到不合理的结果,甚至使计算溢出,无法求得回归分析问题的解。逐步回归是一种能避免由"复共线性"产生的不良影响的回归分析方法。逐步回归的具体运算则使用华东理工大学数学系陆元鸿教授开发的"MATHCAI应用数学方法软件包3.0版(C)"处理。
根据表1的数据,首先对维生素类营养成分进行逐步回归。以X1(生物素)、X2(胆碱)、X3(烟酸)、X4(泛酸)、X5(吡哆醇)、X6(核黄素)、X7(硫胺素)为自变量;以Y(效价)为函数。由计算机处理后得:
Y(效价)=66.19×X2(胆碱)-6.36×104×X1(生物素),复相关系数R=0.982
说明维生素类营养成分中胆碱和生物素是影响效价的主要因子,并且在实验数据的范围内胆碱的用量取最大值,而生物素的用量取最小值。
对氨基酸类营养成分进行逐步回归。以X1(Arg)、X2(Cys)、X3(Gly)、X4(His)、X5(Ile)、X6(Leu)、X7(Lys)为自变量;以Y(效价)为函数。由计算机处理后得:
Y(效价)=8.45×104×X7(Lys)-1.98×104×X1(Arg),复相关系数R=0.985
说明在氨基酸类营养成分的前面7种氨基酸中Lys和Arg是影响效价的主要因子,并且在实验数据的范围内Lys的用量取最大值,而Arg的用量取最小值。
再把Lys和剩余的其他氨基酸共同进行逐步回归。以X1(Lys)、X2(Met)、X3(Phe)、X4(Thr)、X5(Trp)、X6(Tyr)、X7(Val)为自变量;以Y(效价)为函数。由计算机处理后得:
Y(效价)=9.63×104×X4(Thr),复相关系数R=0.983
说明在Lys和剩余的其他氨基酸中,Thr是影响效价的主要因子,并且在实验数据的范围内Thr的用量取最大值。
前面7种氨基酸中Lys是影响效价的主要因子,但Lys和Thr共同进行逐步回归时,Thr是影响效价的主要因子,因此Thr也是所有的氨基酸类营养成分中影响效价的主要因子。
对维生素类和氨基酸类营养成分中影响效价的主要因子共同进行逐步回归。以X1(胆碱)、X2(Thr)为自变量;以Y(效价)为函数。由计算机处理后得:Y(效价)=9.63×104×X2(Thr),复相关系数R=0.983
说明在维生素类和氨基酸类营养成分中影响效价的主要因子是Thr。
使用黄豆饼粉、棉籽饼粉、啤酒酵母粉和玉米浆等不同的氮源时,由于氮源中Thr的含量不同,红霉素的效价也明显不同。吴瑞武[4]等在研究红霉素发酵基础料液体化时,发现有机氮源中对菌丝生长和红霉素效价起作用的主要是某些氨基酸类,本文的研究结果与其相一致。
2.4 对照培养基中添加Thr对红霉素效价的影响
为进一步验证该实验结果,我们向A氮源使用4%的黄豆饼粉作为对照培养基中添加0.05%的Thr,实验结果如图2所示。
从图2可以看出,A氮源使用4%的黄豆饼粉作为对照培养基红霉素的效价为5221μg/ml;I氮源使用4%黄豆饼粉和0.05%Thr的效价为6414μg/ml,比对照培养基红霉素的效价提高22.85%。
3 讨论
本文的研究结果表明红色糖多孢菌在摇瓶中氮源的种类或比例不同,红霉素的效价也明显不同。通过对含有不同氮源培养基的营养成分进行计算,并对其结果进行逐步回归,我们得到黄豆饼粉、棉籽饼粉、啤酒酵母粉和玉米浆等氮源具有的营养成分中Thr是影响效价的主要因子。向发酵水平较低的对照培养基中添加0.05%Thr后红霉素的效价提高了22.85%,证实了数学分析的结果。
众所周知,红霉素的效价受氮源的产地、季节等因素影响很大,其原因就是有机氮源中影响发酵的主要因素研究得不清楚,无法对有机氮源进行有针对性的监控。因此对有机氮源进行深入的研究找出其中影响效价的主要因子,通过调节该主要因子的含量,就能够避免红霉素效价因氮源的产地、季节等因素的波动,从而使工业化大生产处于稳定的状态。
