枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是重要的植物根围促生细菌(PGPR),在植物病害生物防治中起重要作用。枯草芽孢杆菌能够防治植物病害源于其能够产生多种抗菌物质, 包括脂肽类、肽类、磷脂类、多烯类、氨基酸类和核酸类等多种化合物,这些抗菌物质能抑制真菌、细菌、病毒和菌原体等的正常生长[1,2]。枯草芽孢杆菌在自然生长和发酵培养后期产生的脂肽类抗生素是其最重要的抗菌物质。脂肽类抗生素包括伊枯草菌(iturins)、泛革素(fengycins)和表面活性素(surfactin),其中伊枯草菌素和泛革素具有很强的抗真菌活性,而表面活性素对病毒、肿瘤、支原体都有很高的抑制活性[3~7]。通常可以通过优化培养基和发酵条件来提高抗生素的产量。研究表明,优化中生菌素[8]的发酵条件能使其产量提高4倍,达到5 000μg/ml;金核霉素[9]在培养基和发酵条件优化后,产量提高了30%。本实验室对脂肽类抗生素在植物病害防治中的应用进行了系统研究,开发了脂肽类抗生素生物农药(枯草芽孢杆菌脂肽类生物农药和应用,专利号: ZL200310112769·4)。枯草芽孢杆菌G1菌株是本实验室研发的脂肽类抗生素生物农药发酵菌株之一,它能产生脂肽类抗生素表面活性素,对防治辣椒病毒病和烟草病毒病均有较好效果(尚未发表)。本试验旨在研究和优化枯草芽孢杆菌G1菌株的发酵条件和培养基,提高脂肽类抗生素的产量,为进一步中试放大及产业化生产提供依据,从而开辟植物病害生物防治新途径。
1 材料与方法
1·1 供试菌种
枯草芽孢杆菌G1菌株,本实验室保存。油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)分离自南京江浦农场油菜地。
1·2 培养基
①Landy [10]培养基(g/L):葡萄糖20,L-谷氨酸5,KH2PO41,MgSO4·7H2O 0·5,KCl 0·5,酵母粉1,L-苯丙氨酸2×10-3,MnSO45×10-3,CuSO4·5H2O 0·16×10-3,FeSO4·7H2O 0·15×10-3;
②Landy修饰培养基Ⅰ:将Landy培养基的L-谷氨酸换为谷氨酸钠;③Landy修饰培养基Ⅱ:将Landy培养基的葡萄糖换为蔗糖,L-谷氨酸换为谷氨酸钠;④LB培养基(g/L):蛋白胨10,NaCl 10,酵母粉5;⑤无机盐培养基[11]:葡萄糖40g/L,KH2PO430mmol/L,NH4NO350mmol/L, Na2HPO440mmol/L,MgSO4800μmol/L,FeSO44μmol/L,CaCl27μmol/L,Sodium EDTA 4μmol/L。由于添加成分的不同又将无机盐培养基分为6种:①起始Fe2+2mmol/L,在培养70h时添加1·7mmol/L Fe2+;②起始Fe2+2mmol/L,在培养70h时添加2·0mmol/L Fe2+,80h调[a1]pH>5;③起始Fe2+2·0mmol/L在培养70h时添加1·7mmol/L Fe2+,控制pH6·6恒定;④原培养基中不加Mn2+;⑤原培养基中加入0·01mmol/L Mn2+;⑥原培养基中加入0·05mmol/L Mn2+。每处理3次重复,取产生脂肽类抗生素粗提物的平均值。
1·3 主要仪器
高速冷冻离心机AvantiTMJ-25I(美国 BECKMAN公司); 721分光光度计(上海第三分析仪器厂);离心浓缩仪LABCONCO(Centrivap公司);台式pH仪Cyberscan 510(Eutech仪器公司);HPLC explore 100(瑞典安玛西亚公司)。
1·4 种子菌培养
将保存的菌种转接至LB平板上,37℃培养24h;用接种环取活化菌种,接种于含有100mlLB液体培养基的250ml三角瓶中,30℃、200r/min培养24h作为种子菌。
1·5 发酵条件及脂肽类抗生素提取过程pH的优化
发酵过程中采用单因数试验方法,考察不同培养温度(26、28、30、32、34、36℃)、培养时间(26、32、38\44、50、80h)、接种量 (1%、2%、3%、5%、10%;体积分数,下同)、初始pH值(5、6、7、8、9)、培养基(Landy培养基、Landy修饰培养基Ⅰ、 Landy修饰培养基Ⅱ、LB培养基、无机盐培养基)对脂肽类抗生素产量的影响。上述无机盐培养基参照Wei等[11]方法的发酵时间,将其设定为 140h,故不做时间优化。脂肽类抗生素的提取采用酸沉淀法[6]。培养结束后,7000r/min离心10min,去除菌体细胞,在去细胞培养液中加入 6mol/LHCl调节pH为5·0、4·5、4·0、3·5、3·0、2·5、2·0,7000r/min再离心10min,收集沉淀。将沉淀在60℃ 的烘箱中干燥18h,称重即为脂肽类抗生素粗提物的干重。比较不同pH条件下沉淀的干重,以确定完全沉淀脂肽类抗生素所需的最佳pH值。
1·6 脂肽类抗生素的HPLC定量检测[12]
将脂肽类抗生素粗提物过Sephadex LH-20(2cm×50cm)层析柱。流动相为乙醇,每次上样0·3ml,检测波长280nm,流速1ml/min,从1~100min共收集20管, 每管5ml。每管收集液分别经真空干燥后,加入0·2ml乙醇溶解。对每管乙醇溶液进行平板抑菌试验,试验真菌为油菜菌核病菌,将具有抑菌活性的收集液合并在一起,用离心浓缩仪浓缩至完全干燥,即为脂肽类抗生素的干重。
1·7 统计方法
采用SPSS统计软件进行方差分析统计。
2 结果与分析
2·1 发酵时间和发酵温度对脂肽类抗生素产量的影响
以发酵时间为因数,设定为26、32、38、44、50、80h。其他发酵调件恒定为32℃,200r/min,培养基分别为Landy和LB液体培养基。结果表明,培养38h时产生脂肽类抗生素的量达到最高,为6·36g/L。随着发酵时间的延长,产生脂肽类抗生素粗提物的量不再增加或略有减少,因此最佳发酵时间为38h(图1)。以发酵温度为因数,设定为26、28、30、32、34、36℃。其他发酵条件恒定为200r/min,Landy液体培养基,发酵38h。结果表明,发酵温度为30℃时,产生脂肽类抗生素的量最多,为6·30g/L,故最佳发酵温度为30℃(图1)。
2·2 接种量和初始pH值对脂肽类抗生素产量的影响
在Landy培养基条件下,分别以1%、2%、3%、5%、10%接入G1种子菌,32℃,200r/min,发酵38h。结果表明,接种量为3%时产生脂肽类抗生素的产量最高,为6·25g/L。故适宜的接种
量为3%(图2)。
在Landy培养基条件下,用HCl和NaOH溶液将发酵液的初始pH值分别调为5·0、6·0、7·0、8·0、9·0,结果表明,pH值为7·0时脂肽类抗生素的产量最高,为6·20g/L。故最佳起始pH值为7·0(图2)。
2·3 最佳培养基的选择
分别采用不同的培养基,选择上述试验获得的最佳发酵条件即初始pH值7·0,接种量3%,发酵温度30℃,转速200r/min,发酵38h(无机培养基发酵时间为140h)。由表1可以看出,Landy培养基产生脂肽类抗生素粗提物的量最多,为6·50g/L,产生纯的脂肽类抗生素的量也最多为 2·40g/L。所以枯草芽孢杆菌G1菌株产生脂肽类抗生素的最佳培养基为Landy培养基。而同样是Landy培养基,将它的碳源由L-谷氨酸换为谷氨酸钠后,其产生脂肽类抗生素粗提物的量仅为3·10g/L,产生纯的脂肽类抗生素仅为1·10g/L,不到原来的一半;而将L-谷氨酸换为谷氨酸钠同时将葡萄糖换为蔗糖产生脂肽类抗生素粗提物的量更少,仅为1·35g/L。产生纯的脂肽类抗生素仅为0·42g/L。LB培养基产生脂肽类抗生素粗提物和纯化物的量分别为1·85和0·62g/L。6种无机盐培养基发酵140h产生纯脂肽类抗生素的量都很少,最多不超过0·81g/L。这与曾报道的枯草芽孢杆菌ATCC21332在上述相同无机盐培养基和培养条件下最多产生纯的脂肽类抗生素达3·5g/L[11~13]相差甚远。综合上述试验结果,枯草芽孢杆菌G1菌株产生脂肽类抗生素的最佳发酵条件为Landy培养基,初始pH7·0,接种量3%,发酵培养温度30℃,发酵时间38h。
2·4 脂肽类抗生素完全沉淀时所需的pH值
枯草芽孢杆菌产生的脂肽类抗生素分泌于菌体细胞外,发酵液经第一次离心后,产生的脂肽类抗生素存在于上清液中,加酸可使其沉淀。本试验中我们用HCl对在landy培养基,最佳发酵条件下发酵上清液进行沉淀(图3),当pH达到4·0时沉淀(脂肽类抗生素粗提物)干燥后的重量达到6·30g/L,而继续加HCI使pH达2·0时沉淀干燥后的重量为6·50g/L。脂肽类抗生素粗提物的产量没有明显增加,所以提取脂肽类抗生素时选择pH4·0比较适宜。
2·5 脂肽类抗生素的HPLC检测
取在60℃的烘箱干燥过的脂肽类抗生素粗提物按1∶2(质量浓度)溶解于无水乙醇中,7000r/min,离心10min,将上清液浓缩至原体积的1/2,过Sephadex-LH20层析柱。在 Landy培养基,最佳发酵条件下获得脂肽类抗生素粗提物过柱后(图4)的生物活性检测结果(图5)表明:第6~14管具有抑菌活性。把第6~14管的收集液合并,用离心浓缩仪浓缩至完全干燥后称重和换算,Landy培养基产生的纯脂肽类抗生素量最多,为2·40g/L(表1),而其他几种培养基产生的纯脂肽类抗生素均低于Landy培养基。
3 讨论
枯草芽孢杆菌脂肽类抗生素在防治植物病害上具有广阔的应用前景,但由于其产量不高使其应用受到限制。通过研究枯草芽孢杆菌的发酵技术和对其进行遗传改造[14]可以提高脂肽类抗生素产量。本试验通过优化发酵条件,使发酵获得的纯脂肽类抗生素达到了2·4g/L初步达到了工业化生产要求文献报道[11,13]在发酵枯草芽孢杆菌ATCC21332菌株的过程中添加Fe2+或Mn2+能大大促进脂肽类抗生素的产生,在无机盐培养基①、 ②、③、⑤中发酵140h后,分别能产生纯的脂肽类抗生素3·5、3·0、2·2和2·6g/L。而在本试验中作者用与文献报道的相同培养基,在相同培养条件下发酵枯草芽孢杆菌G1菌株,产生纯的脂肽类抗生素分别为0·81、0·25、0·55和0·58L,与报道的结果相差甚远。考虑到可能是不同菌株所需的营养和培养条件不同,于是我们用文献中相同的菌株ATCC21332进行同样的试验,但仍未得到论文中的结果,而且差别很大,产生脂肽类抗生素粗提物的干重最多也只有3·5g/L,纯脂肽类抗生素1·1g/L(另文发表)。在以往的文献[14]中,完全沉淀脂肽类抗生素时,通常调pH值至2·0,而在本试验中作者发现在pH值至4·0时,脂肽类抗生素就几乎完全沉淀了,这样在工业化生产时减少了酸的用量同时处理废液时也减少了碱的用量,从而降低成本和保护环境。由于发酵的目的产物不同,发酵的时间也有很大差别。薛健等[15]报道纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)液体发酵产生纳豆激酶(Nattokinase)的发酵周期3d;柴萍萍等[16]报道芽孢杆菌WY45产生B-甘露聚糖酶的培养时间为 96h;而作者研究的枯草芽孢杆菌G1菌株产生脂肽类抗生素的最佳发酵时间仅为38h。
除对发酵和提取条件进行优化外,还可以采用基因工程的方法克隆和转化生物合成调控基因,来大幅度提高目标发酵产物的产量。我们在以往的研究中克隆了脂肽类抗生素生物合成调控区的基因[14],将其中的lpaB3 基因转入168菌株中获得了高产菌株[6]。而另一调控基因asp基因可能参与将氨基供体谷氨酸的氨基转移给酮戊二酸生成天冬氨酸,而天冬氨酸和天冬酰胺是脂肽类抗生素肽链的组分,该基因与脂肽类抗生素高产有重要关系,有关研究正在进行之中。
