摘要：
目的 采用薄层色谱法检查司丙红霉素中的有关物质。
方法 司丙红霉素供试品经无水乙醇溶解后，以二氯甲烷—乙酸乙酯—甲苯—乙醇—浓氨溶液（3∶4∶2∶1∶0.2）为展开剂，在硅胶G板上展开，喷以显色液（取硫酸铈1g与钼酸钠2.5g，加10%硫酸溶液使溶解成100ml），置105℃加热数分钟显蓝色斑点。
结果 经方法学验证，本法最小检测限为1mg，能有效分离并检测本品的有关物质及稳定性留样的降解产物。
结论 该方法分离效果好，操作简便，测定结果准确，重现性好。稳定性研究结果表明，本品应遮光，严封，25 ℃以下保存。
关键词：司丙红霉素；有关物质；薄层色谱法；稳定性试验
司丙红霉素（红霉素丙酸酯-N-乙酰半胱氨酸盐（1:1）[1]）为半合成红霉素类
抗生素，该品由Refarmed公司首创，于1995年由lindopharm公司开发上市，商品名Erysec，临床上用于治疗呼吸系统、泌尿道、皮肤、口腔、耳鼻喉等感染，具有较好的疗效。司丙红霉素作为一种新的红霉素衍生物，具有抗菌活性强[2]，药代动力学优势明显[3～5]，临床疗效好，副作用小[6]等优点，开发该药品具有良好的经济效益和市场前景，我所于2000年开始试制。由于本品只在紫外末端有吸收，HPLC检测结果不理想，因此，本文对薄层色谱条件进行筛选比较，研究建立了分离效果好、检测灵敏度高TLC方法检测本品的有关物质。
1 材料与方法
1.1 材料与试药
红霉素标准品：批号，3079312中国药品生物制品检定所标定，效价885u/mg。乙酰半胱氨酸对照品：四川峨眉荣高生化有限公司生产。含量：100.3%（符合中国药典2005年版对本品纯度的规定），批号：01039。丙酰红霉素（红霉素丙酰酯）、司丙红霉素样品均由四川抗菌素工业研究所制备。
薄层板：硅胶G板（10cm×20cm玻璃板，涂铺硅胶4g）；硅胶G：化学纯，青岛海洋化工集团公司出品；硫酸铈，钼酸钠，二氯甲烷，乙酸乙酯，甲苯，乙醇，氯仿及其他试剂均为分析纯。
1.2 检查方法
取本品，加无水乙醇制成每1ml中含20mg的溶液，作为供试品溶液；另精密称取红霉素标准品适量，加无水乙醇制成每1ml中含0.6mg、0.4mg、0.2mg和0.1mg的溶液分别作为对照溶液（1）、（2）、（3）和（4）（对照溶液浓度可根据样品中杂质含量的具体情况作调整），照薄层色谱法（中国药典2005年版二部附录VB）试验，精密吸取上述供试品溶液和对照溶液各10µl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二氯甲烷—乙酸乙酯—甲苯—乙醇—浓氨溶液（3∶4∶2∶1∶0.2）为展开剂（浓氨溶液在临用前加入），展开后，晾干，喷以显色液（取硫酸铈1g与钼酸钠2.5g，加10%硫酸溶液使溶解成100ml），置105℃加热数分钟，至出现蓝色斑点。供试品溶液如显杂质斑点，除原点外（为乙酰半胱氨酸），其余各杂质斑点所显颜色分别与对照溶液（1）、（2）、（3）、（4）所显主斑点的颜色比较，计算杂质总量。
2 实验结果
2.1 不同展开系统的比较
称取红霉素标准品、丙酰红霉素样品、司丙红霉素样品各适量，分别加无水乙醇溶解并稀释制每1ml中约含20mg的溶液；取乙酰半胱氨酸对照品适量，加无水乙醇溶解并稀释制每1ml中约含10mg的溶液；取已配制红霉素、丙酰红霉素及司丙红霉素供试液各适量等体积混合。分别吸取上述5种溶液各10µl依次点于同一薄层板上。平行操作三块板，用以下所列的3个系统展开，并将展开后晾干的薄层板喷以相同显色剂（中国药典收载的红霉素的TLC显色剂），置105℃加热数分钟，至出现蓝色斑点。对比A，B，C三个展开系统的分离效果，结果列于表1。
A系统 二氯甲烷—乙酸乙酯—甲苯—乙醇—浓氨溶液（3∶4∶2∶1∶0.2）（浓氨溶液在临用前加入） （自选）
B系统 浓氨溶液饱和的乙酸乙酯[7]
C系统 甲醇—氯仿（85∶15）（薄层板在甲醇中预展至顶端并干燥）[8]
表1 不同展开系统的比较
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展开剂
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Rf值
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司丙红霉素（主斑点）
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丙酰
红霉素
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红霉素
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杂质1
(紧靠主斑点下方)
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乙酰半胱
氨酸
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A系统
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0.68
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0.68
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0.49
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0.62
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原点
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B系统
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0.82
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0.82
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0.75
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0.78
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原点
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C系统
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0.72
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0.72
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0.46
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未检出
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0.72～0.90
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注：主斑点指丙酰红霉素斑点，以下均同。Rf值受环境因素及层析操作的影响较大，但在选定的薄层系统下，其相对移动次序不会改变。
结果表明（图谱略），本品在A、B、C三个展开系统中均离解为丙酰红霉素与乙酰半胱氨酸。
A系统能将主斑点与红霉素及其它有关物质全部清晰分离。各物质的Rf值适中。乙酰半胱氨酸在原点显示蓝色斑点。
B系统中各物质的Rf值太接近。紧靠主斑点下方的杂点1与主斑点以及红霉素均不能清晰分离。乙酰半胱氨酸在原点显示蓝色斑点。
C系统中，丙酰红霉素斑点形状不规则，且拖尾严重，杂点1无法视别；同时，乙酰半胱氨酸紧连丙酰红霉素的上端，呈条状色斑，若丙酰红霉素上方出现杂点，则难以分辨。
因此，A系统的分离效果优于B、C系统，选择A系统作为TLC有关物质检查用展开系统。
2.2 显色剂的检出限以及对杂质的最小检出含量
选用中国药典收载的红霉素及大多数同类物质（乳糖酸红霉素、硬酯酸红霉素等）所采用的显色剂。该显色剂为：取硫酸铈1g与钼酸钠2.5g。加10%硫酸溶液使成100ml，即得。
由于司丙红霉素在选定展开剂中离解为丙酰红霉素与乙酰半胱氨酸，因此，不宜用本品考察显色剂的检出限，而选择其主要杂质红霉素来进行检出限试验。
将红霉素标准品分别以0.5、1、2、3、4、5、6µg的量点于同一薄层板上，用A系统展开后，晾干，喷以显色剂，置105℃加热数分钟，至出现蓝色斑点。图谱显示,1µg的点样量，即能较清楚地检视，因此，该显色剂的显出限为1µg。同时，由于供试品的点样量为200µg，因此，显色剂对杂质的最小检出含量为0.5%。
2.3 供试品溶液点样量的选择
将司丙红霉素样品以50、100、200、300µg的浓度梯度点样，进行薄层层析，结果表明点样量从100µg以后增至300µg，杂质斑点数未见增加，但300µg时，斑点已开始扩散，因此，供试品溶液的点样量应大于等于100µg，小于300µg。
结合上述对照品的点样量需大于1µg的结论，为了实现对样品中0.5%的杂质有效检出的目的，供试品溶液的点样量选择为200µg。
2.4 溶剂的选择及供试液的稳定性
取司丙红霉素样品适量，分别以无水乙醇、乙醇、甲醇、乙酸乙酯及二氯甲烷为溶剂配制成司丙红霉素的等浓度（20mg/ml）溶液，取该5种溶液各10µl点于同一硅胶G薄层板上，用选定的展开剂及显色剂进行TLC检查。结果表明，本品在乙酸乙酯、二氯甲烷中，杂质1[紧挨主斑点下方，其相对Rf值（Rf值与丙酰红霉素的Rf值之比）约为0.93]、杂质2（红霉素，位于杂质1的下方，其相对Rf值约为0.7）的量高于其它三种溶剂。亦即，本品在这两种溶剂中即发生降解。因此，这两种溶剂不能作为供试液配制溶剂。
同时，图谱显示，本品在无水乙醇、乙醇、甲醇三种溶剂中的杂质量相当。因此，对这三种溶液每隔1小时取样，进行TLC比较检查。结果表明，本品在无水乙醇与乙醇溶剂中，3小时内，杂质基本无变化，即，3小时内稳定。而在甲醇溶剂中，2小时点样，杂质2增加，杂质3（紧挨主斑点上方，系降解产物，其相对Rf值约为1.1）开始出现。
综上两项试验结果，选择无水乙醇作为TLC检查供试液配制溶剂。供试液的稳定时间为3小时。
2.5 司丙红霉素的有关物质检查
照1.2项下的方法检查，对照溶液配制成每1ml中含0.1mg、0.2mg、0.4mg和0.6mg的溶液。供试品溶液如显杂质斑点，除原点外（为乙酰半胱氨酸），其余各杂质斑点所显颜色分别与对照溶液（1）、（2）、（3）、（4）所显主斑点的颜色比较，计算杂质总量。三批司丙红霉素的有关物质检查结果列于表2。
表2 司丙红霉素有关物质检查结果
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样品批号
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杂质1
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杂质2
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杂质3
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总杂质个数
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有关物质总量
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010420
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3%
|
0.5%
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\
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2
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3.5%
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|
010422
|
3%
|
0.5%
|
\
|
2
|
3.5%
|
|
010429
|
\
|
1.5%
|
\
|
1
|
1.5%
|
2.6 司丙红霉素稳定性考察
取本品（010420）进行了影响因素、加速试验与长期留样考察，以该法测定其降解产物。结果表明，司丙红霉素对光不太稳定；对热（40℃以上）不稳定；对湿不稳定（相对湿度75%及92.5%），有较强的引湿性。30℃（相对湿度约60%）加速试验6个月基本稳定；25℃（相对湿度约60%）长期试验1年基本稳定。
表3 司丙红霉素稳定性考察结果
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保存条件
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保存时间
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杂质1(%)
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杂质2(%)
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杂质3(%)
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有关物质
总量(%)
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4200LX光照
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10d
|
3.0
|
0.5
|
0.5
|
4.0
|
|
40℃烘箱
|
10d
|
4.0
|
1.0
|
2.0
|
7.0
|
|
60℃烘箱
|
10d
|
4.0
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2.5
|
10.0
|
16.5
|
|
25℃，75%RH
|
10d
|
3.5
|
2.5
|
1.5
|
7.5
|
|
25℃，92.5%RH
|
10d
|
3.5
|
4.0
|
1.0
|
8.5
|
|
40℃，75%RH
|
180d
|
2.5
|
14.0
|
7.0
|
28.0
|
|
30℃，60%RH
|
180d
|
3.0
|
2.5
|
2.5
|
8.0
|
|
25℃，60%RH
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1a
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3.0
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4.0
|
3.0
|
10.0
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3 讨论
3.1 显色剂对杂质的检出限试验显示，该杂质每增加1µg，其色斑颜色也成正相关加深。因此，用已知量的该杂质色斑与样品中相同杂质色斑的颜色比较，来判断其中该杂质含量的检查方法是科学的，可靠的。同时，从本品的浓度梯度点样试验发现，随着样品量的递增，其中所含杂质的色斑颜色也成正相关加深。因此，用已知量的红霉素对照品色斑颜色与供试品中的杂质色斑颜色比较，来衡量其中杂质的相对量的检查方法，能在一定程度上相对量化所含杂质。
3.2 将该有关物质检查法试用于高温（100℃）破坏、酸破坏以及甲醇溶液中放置2小时后和高湿度下破坏样品的降解产物检查，结果表明，能将产生的降解产物很好地分离。另外，有关物质供试液浓度选择试验已显示，200µg为最佳杂质检查用供试品点样量，因此，检查降解产物的点样量也定为200µg（供试液浓度20mg/ml，点样10µl）。该法对降解产物的最低检出含量为0.5%，基本满足降解产物检查的要求。
3.3 考虑到TLC法测定有关物质时其量化功能较差，因此，配制了4个浓度的对照溶液，以增加测定结果的准确性。同时，将司丙红霉素样品用该法重复检查三遍（隔日），均显相同结果（即检出的杂质点数不变，量值在同一水平上），因此，该限量检查法具有重复性。
3.4 本法经实验证明也适用于司丙红霉素片的有关物质测定，辅料无干扰。
参 考 文 献
[1] WO 00/23081：13
[2] 北京科学出版社 当代结构药物全集
[3] Von Fritz Sorgel al Deutsche Apotheker Zeitung 136,37 12.9.1996
[4] G.Ricevuti al Chemotherapy 34:374-379 (1988)
[5] M.De Bernardi al International Journal of Clinical Phamacology Vol 26 No.9 444-447(1988)
[6] C.F.marchioni al Italian Journal of Chest Diseases Vol.45 13-20(1991)
[7] 中华人民共和国卫生部药典委员会。中华人民共和国药典（二部）2005年版。北京：化学工业出版社，2005：352
[8] 中华人民共和国卫生部药典委员会。中华人民共和国药典（二部）2005年版。北京：化学工业出版社，2005：342
