[摘要]：大观霉素是一种氨基糖苷类抗生素，因毒副作用小，且在动物体内几乎不残留，成为兽医用药的首选品种之一。本文对大观霉素的菌种选育、生物合成、检测方法及其在畜牧业中的应用前景等方面进行了较为全面的综述。
[关键字]：大观霉素；育种；合成；检测
大观霉素(spectinomycin)是一种由大观链霉菌(scret)torn~es spectabilis)产生的氨基糖苷类抗生素。我国自1971年首次分离出大观霉素产生菌以来，虽经一系列研究，但发酵效价仍不很理想[1]。为了更好地促进兽用大观霉素的开发和利用，笔者综述了有关大观霉素的研究进展。
1、大观霉素的菌种选育
诱变育种、细胞融合育种和基因工程育种是菌种选育的二条主要途径。
1.1 诱变育种 这是一种传统的、非常有效的育种手段。随着科学技术的发展，一些新的诱变手段不断出现，为这种传统的育种方法注入了新的活力。向砥等[2]通过离子注入法选育高产大观链霉菌，获得了大观霉素效价较出发菌株提高102.3％的变异株，王宏斌等[1]通过原生质体诱变技术使大观霉素产量提高了17％。但是，由于诱变的随机性，要得到各方面性状都比较优良的菌株难度很大，大多数情况下得到的往往是某一个性状有缺陷的菌株，如大观霉素发酵效价高的菌株其生长速度可能较慢，而生长速度快的突变株发酵效价可能不很理想，在这种情况下，对这两类菌株进行原生质体融合将是一种有效的育种手段，有可能筛选到既有较高发酵效价，又生长迅速的融合菌株。
1.2 原生质体融合育种 将两亲本菌株培养至对数生长期，在高渗溶液中用溶菌酶处理，制备成原生质体，然后用聚乙二醇(PEG)等化学融合剂或电刺激等物理手段使两原生质体融合，在再生培养基上筛选出符合要求的融合子。有资料显示，放线菌的原生质体融合频率可达10-2～10-1，因此，既使不对原生质体进行了标记，也可方便地筛选到所需融合子。因为生长迅速的菌株菌落往往较大，发酵效价高的菌株一般耐大观霉素能力强，因此可在大观霉素梯度平板上筛选得到[3]。
l.3 基因工程育种 基因工程育种十一种分子水平上的育种技术，它可通过定向地增加某些有用基因或敲除某些不利基因来提高抗生素的表达量。研究发现，合成大观霉素的一系列基因通常位于同一基因串(gene elusler)上。韩国学者利用cosmid质粒构建了大观霉素生物合成基因的基因文库(cosmid gene library)，发脱其中有一个cosmid包含了21个完整的开放阅读框架(ORF)和2个不完整的开放阅读框架，并推导出大观霉素生物合成所需的16个蛋白质(SpcRNTABCDXEYFGHIJK)[4，5](http：//www.ibr.0r.kr)。Walker[6，7]发现谷氨酰胺-氨基环醇氮基转移酶(glulamine-aminocyclitolaminotransterase)和二氨环醇氮基转移酶(diamino-cyclitol aminolransfemse)在大观霉素合成中有重要作用。Jo等[8]发现dTDP-葡萄糖合成酶、肌醇单磷酸酶和肌醇脱氢酶参与的反应是大观霉素生物合成的早期步骤；Hyun等[9]。和Sohng等[10]还把编码dTDP-葡萄糖合成酶和dTDP-D-葡萄糖4，6-脱水酶的基因通过cosmid质粒转化到大肠杆菌中，使相关基因得到表达。因此，如果能用穿梭质粒作为载体，将大观霉素生物合成基因转化到大观链霉菌中，有可能使大观霉素产量大大提高。
1.4高效筛选 菌株的筛选氏菌种选育过程中最为关键的步骤。马秀芬等[11]通过菌落形态变异来筛选高产菌株，研究发现梅花型菌落的抗菌活性最高，圆形菌落次之，光秃型菌落几乎没有抗菌活性；于广成等[3]通过产色素变化和自身耐药浓度的变化来选育高产菌株。菌落形态和产色素突变虽是一些比较容易判断的形态指标，但这些指标与大观霉素产量之间缺乏科学的相关依据，用大观霉素梯度平板来筛选自身耐药菌株是一个不错的选择，因为大观霉素高产菌株首先必须要耐受高浓度的大观霉素。但是，能耐大观霉素的菌株却不一定是高产菌株，因为已经发现大脱霉素的抗性与大观霉素磷酸转移酶(spectinomycin phosphoransferase)等某些大观霉素抗性酶有关[8]，Lyutzkanova等[12]还从大观霉素产生菌s．flavopersicus中克隆了大观霉素的抗性决定子，发现其含4个开放阅读框架，其中的一个与氨基糖苷磷酸转移酶相似，另一个与链霉素生物合成基因串中的调节蛋白相似。因此即使用梯度平板法，大规模的筛选仍不可避免。研究者曾经开发过一个用于微生物菌种选育的高效筛选模型[13]，该模型利用
多孔板进行液态培养，一次可处理几万个突变株，湿室培养后可从透光率判断菌体的生长情况。将多孔板浸至氯化钙溶液中，使孔内液体固化后，还可直接覆盖于涂有指示菌的培养基上，进行抑菌能力的测定，使筛选效率大大提高。
2、大观霉素的生物合成
通过遗传学研究，结合现代生理学研究技术，目前基本搞清了大观霉素的生物合成途径：大观霉素是由葡萄糖经一系列反应生成的放线胺(actirlairline)和大观糖(spectinose)经酶促缩合而成的[14]。见图l。
对大观霉素这类次生代谢产物来说，其发酵效价除了与遗传特性有关外，还受到环境条件的影响。、于广成等[15]曾对大观霉素发酵培养基进行过优化，探讨了碳氮源的种类及配比对发酵的影响；马秀芬等[16]就环境因子对大观链霉菌发酵的影响进行过实验，发现无机磷酸盐抑制大观霉素的合成，硝酸盐促进其合成。此外，他们还发现稀土元素不但可以促进大观链霉菌的生长，而且发酵效价也能提高7％～8％左右。但到同前为止，有关酶的诱导、分解代谢产物的解阻遏、能荷的调节，产物的反馈抑制、抗生素的分泌特性等研究尚没有得到很好地开展。国外在这方面的工作由于技术保密等原因而少见报道，只有Gomes等[17]对分批培养下大观霉素的生物合成进行过研究，提出了氧传递速率是限制发酵效价的关键因素这一论断。
微生物在合成次级代谢产物时，一般都同时产生结构上类似的多种副产物，大观链霉菌也不例外。在合成大观霉素的同时，也会合成二氢大观霉素和二羟大观霉素等结构类似物[18]因此，如果能从生理上搞清大观霉素及其他副产物的合成途径，就可有的放矢地采取生理和遗传的手段抑制代谢旁路的进行，使大观霉素在发酵液中得到富集。
大观霉素的分泌特性对发酵收率也有较大的影响。通过生理或遗传学手段改变细胞壁和细胞膜的组分，可加速大观霉素的分泌，减少由于大观霉素积累而造成的反馈抑制，从而提高抗生素的产量。
3、大观霉素的检测方法
测定大观霉素的方法大致有萃取光度法、杯碟法、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、离子对高效液相色谱电化学检测法等几种。萃取光度法是最简单的一种测定方法，用溶剂(二硫化碳：吡啶：异丙醇：30：20：50，V/V)萃取后，加显色剂(氯化铜的吡啶水溶液)显色，然后测定470 nm处的吸光度即可获知大观霉素的近似含量[19]，该法虽然操作简单，但特异性不强，测定误差大，在实际工作中很少采用。杯碟法是《中国药典》规定的大观霉素分析方法[20]，根据样品对肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)的抑菌圈大小来确定其生物效价，但该法只适用于人脱霉素的纯品，采用该法确定发酵液中的大观霉素含量或畜禽产品中大观霉素的残留量似乎不太现实，囚为发酵液或畜禽产品中除了大观霉素外，往往还会有其它抗菌物质，向杯碟法缺乏选择性，测得的是所有抗菌物质的总效价。高效毛细管电泳法(HPCE)不需用有机溶剂，可用紫外来检测，而且该方法具有重现性和回收率较好，测定速度快等优点[21]，但因与杯碟法存在较大误差，因此还没有被广泛认可。色谱检测法可能是一种比较理想的方法。美国药典把甲硅烷基化后的气相色谱方法作为含量测定的标准方法[22]。Hamamoto等[23]曾用高效液相色谱(HPLC)法对畜产品中残留的大观霉素含量进行过测定，由于大观霉素本身没有任何可用的紫外吸收特征(大观霉素的最大紫外吸收在190 nm，与有机溶剂的紫外吸收重叠)，在进行HPLC分析时必须用柱前衍生或柱后衍生等方法将大脱霉素转化成可检测的形式，因此测定步骤比较繁琐。用离子对高效液相色谱配以电化学检测器测定大观霉素可能是一种有潜力的测定方法，该法不需要柱前或柱后衍生，不仅误差小，耗时短(大约40分钟)，而且林可霉素等其他抗生素不会对测定起干扰作用[18]，欧洲药典正考虑用该法代替气相色谱法作为标准方法[24]。
4、大观霉素在畜牧业中的应用前景
随着世界范围内自由贸易的兴起，绿色壁垒已代替关税壁垒成为农副产品出口中遇到的首要问题，为了改善畜禽产品的质量，使用安全高效的兽药至关重要。大观霉素具有毒性低，在有效剂量范围内对哺乳动物的肝、肺、肾等毒副作用小等优点，正在成为兽药的首选品种之一。研究表明，大观霉素能有效治疗和预防由链球菌、丹毒丝状菌、金黄色葡萄球菌、巴氏杆菌、大肠杆菌、沙门氏菌及支原体引起的畜禽疾病，尤其对支原体和大肠杆菌混合感染效果显著[25,26]。作为一种新型兽用抗生素，大观霉素的抗性菌株少，Schwarz等[27]对302株牛呼吸道感染病原细菌菌株的抑菌试验表明，大观霉素的总有效率达93.5％～98％。此外，大脱霉素还有毒副作用小的优点，按农业部《兽药试验技术规范》进行小白鼠灌服试验未发现任何毒性反应[28]。大观霉素肌肉注射吸收良好，约lh内血中浓度可达高峰，6 h后约有80％从尿中排出，给药48 h后几乎100％从尿中排除，残留量极低。除了已广泛使用的盐酸大观霉素外，美国FDA还于1998年审批通过了硫酸大观霉素作为兽药及饲料添加剂的上市申请[29]。因此大观霉素作为兽药或饲料添加剂具有广阔的应用前景。
