周朝晖X 吴艳 董蕾 叶辉 武济民
(中国科学院上海药物研究所, 上海200031)
摘 要 为提高海南霉素产量,分别对其产生菌进行氮离子束注入,原生质体再生等处理,获得高产菌株227,Y81.对菌株Y81进行了碳,氮源考察,并采用均匀设计方法对培养基进行优化,最终摇瓶效价达到
3000m g L以上.
关键词 海南霉素; 离子束注入; 诱变; 发酵
海南霉素是从稠李链霉菌东方变种培养物中提取获得,系我所于80年代初发现得到的新聚醚类抗生
素[ 1～3 ].海南霉素通过与球虫细胞的内脂层结合,诱导被动失钾,引起细胞内A T P大量水解,膜及胞内pH值改变,细胞的离子运输系统被破坏,导致细胞内蛋白质合成停止,最终使球虫生长发育 受阻或被杀灭.多年来经菌种诱变和发酵条件研究,菌株产生抗生素的能力不断得到提高.本文主要报道海南霉素产生菌HN61的诱变研究及利用均匀设计方法确定最佳发酵培养基配方所取得的结果.
1 材料和方法
1.1 菌株
稠李链霉菌东方变种(S trep tom y cesp ad anusva r.d ongf ang ensls)HN61.
1.2 培养基
斜面培养基(%):可溶性淀粉1. 0,酵母浸出粉0. 5,植物胨1. 0等,琼脂粉1. 5%.pH7. 2.
种子培养基(%):N aC l0. 2,M gSO4 7H2O0. 05,K2H PO4 3H2O0. 02,CaCO30. 6.碳,氮源按实验要求加入.pH7. 2.
发酵培养基(%):M gSO4 7H2O0. 05,N aC l0. 2,CaCO30. 3.碳,氮源按实验要求加入.pH7. 2.
1.3 培养条件
取沙土管中的孢子,接种于斜面, 28℃培养7d,接种2～3代斜面,备用,挖块法接种.500m l三解瓶内装500m l培养液,摇床转速为220r m in,培养温度为28±1℃.种子培养时间48h.发酵时间为120h.接种量为5%.
1.4 效价测定方法
检定菌为枯草芽孢杆菌(B acillussubtilis)63501.用纸片法测定.
1.5 离子束注入及原生质体形成和再生
用微量移液管取单孢子悬液50Ll(108个 m l),在无菌条件涂布于2cm×2cm载玻片上,超净台内自然吹干后,采用能量为50Kev的氮离子束按不同剂量注入.
原生质体稳定液(m ed iumP),原生质体再生培养基采用R2培养基[ 4 ].
2 结果
2.1 海南霉素产生菌的诱变系谱
2.2 离子束注入对产生菌的影响
菌株HN61经常规的物理,化学因子诱变及第8代后作自身代谢产物耐受处理,选育出菌株80,经普通培养基验证,效价提高30%.再以80为出发菌株,采用离子注入技术,连续两代处理,获得菌株323和227,效价比HN61提高2～3倍.由于离子束注入是在真空状态下进行,真空对孢子也有很大的杀伤力,因而不同的离子束注入剂量和真空损伤这两个因素对死亡率都有影响(图1).
真空死亡率= 1-离子束注入后存活菌落数真空对照存活菌落数×100%
强大的氮离子注入,直接对处理的孢子导入质量与能量,进而使菌株的遗传信息表达及抗生素合成均可能受到影响.我们在诱变处理的试验中观察到,在平皿上除正常形态的菌落外,又出现了以下3种类型的菌落:(1)少量的光秃型菌落,边缘整齐呈圆形,无孢11 中国抗生素杂志1999年2月第24卷第1期
X周朝晖:女,生于1970年,硕士.
图1 注入剂量和真空损伤对死亡的影响注入离子(N+)剂量为1×1013ion s cm2子;(2)半光秃型菌落,菌落顶部有少量灰白色孢子,菌落底部无孢子;(3)小型菌落,边缘整齐,菌落小而圆,孢子丰满,仅占正常形态菌落面积的1 3～1 4.经大量变株摇瓶实验得到的统计结果看出:光秃型及半光秃型菌落中近一半为零变株,另一半效价较对照株有所降低,为负变株;小型菌落中效价有所提高的比例近20%为正变株.菌落形态的不同似乎与海南霉素的合成能力有一定的关系.
2.3 不同碳,氮源对海南霉素发酵的影响
以原发酵培养基为基础,固定氮源,分别以葡萄糖,半乳糖,甘露糖,果糖,乳糖,蔗糖,甘油,玉米粉,可溶性淀粉,淀粉作为碳源,浓度均为4% ,考察它们对变株的发酵效价及菌丝量积累的影响,结果见表1.
由表1看出,所考察的多种碳源,多糖类中淀粉对海南霉素变株菌丝的生长及抗生素的合成最合适;甘油提供的三碳骨架可能利于海南霉素结构的形成,这类似于另一聚醚类抗生素马杜米星[ 5 ];而单糖及双糖均不利于产物的积累,这与出发菌株HN61能利用葡萄糖和蔗糖有所不同.
同样,以原发酵培养基为基础,固定碳源,氮源分别采用1%的N H4C l,N H4NO3,(N H4)2SO4,黄豆粉,鱼粉,谷蛋白,蛋白胨,植物胨,酵母粉,无毒棉子粉等原材料,经过测定发酵效价及菌丝量以考察不同氮源对变株发酵的影响,结果见表2.
表1 不同碳源对发酵效价及菌丝量的影响
碳源相对效价3(%)菌丝量(%)碳源 相对效价3(%)菌丝量(%)
葡萄糖< 1035蔗糖 < 1019半乳糖< 1018甘油 46. 544甘露糖< 1035玉米粉 6. 828果糖 < 1029可溶性淀粉58. 748乳糖 F0. 1,F检验通过.分析上述方程,相关系数r= 0. 9999,表明线性关系良好.
优化条件为:A= 6. 89,B= 0. 32,C= 0. 63,D=0. 31,代入回归方程,得优化值Y= 3295. 22(m g L).
根据公式:Y=Y±Ua S,a= 0. 02时,查表得Ua= 2. 3263,代入上式得:Y= 3295. 22±60. 8,即在优化条件下安排试验,预测的结果在3235. 04～3355. 4(m g L)之间.
按优化条件进行3批摇瓶试验,测得的发酵结果分别为:Y1= 3391. 05,Y2= 3328. 86,Y3= 3298. 03,结果在预测范围内或稍有偏高,方程得到了验证.
3 讨论
离子束注入诱变具有突变范围广和突变程度高的特点[ 6 ].在我们的实验中观察到,海南霉素产生菌经氮离子注入后,菌落形态发生较大变化,与之相关的抗生素合成产量也有很大的不同.如改变不同的离子源进行离子束注入实验,也许结果又有所变化.目前在农业育种,品种改良等实际应用中,离子束注入技术发挥了一定的作用,也产生了可观的经济效益,而在抗生素产生菌诱变育种中,其机理还值得进一步探索.微生物原生质体再生成正常细胞的过程常伴随着基因突变,进而使次级代谢产物的调节发生变化[ 7, 8 ].
通过原生质体再生以获得高产优质菌株的方法在抗生素菌种选育中已被广泛运用.本文实验采用离子束注入得到的菌株502,经过原生质体再生复合处理后,从再生菌落中分离获得菌株Y81,摇瓶发酵效价有了明显提高,再一次证明了原生质体再生技术用于抗生素育种,是一操作快捷,效率高的有效手段.
抗生素菌种选育和发酵条件的控制是两个相辅相成的环节.为了使新获得的突变株发挥其最大的生产优势,有必要改进发酵工艺和发酵培养基组成以与之相适应.抗生素发酵受多种因素影响,而均匀设计具有实验次数少,用计算机快速,准确地处理实验数据,定量分析各因素对实验结果的影响,定量预报优化条件及优化结果的区间估计等诸多优点[ 9 ],因此在优化海南霉素发酵培养基组成时,我们采用了该方法.从实验得到的方程式可看出,所考察的4个因素对实验Y的影响大小依次为A>C>B>D,其中A(淀粉)的影响为正效应,B(蛋白胨)的影响为负效应,C,D的优化条件没有选择极值,而在考察范围之中.另外,我们在实验中所考察的淀粉,酵母粉,蛋白胨等原材料都是海南霉素工业试生产中所采用的原材料,从而避免了天然产物质量不稳定可能带来的问题.
致谢:本论文的离子束注入实验由中国科学院冶金研究所柳襄怀,林梓鑫老师与陈宇同学协助完成,深致谢意.
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(1998年6月10日收稿)
Stud iesonthem utationandferm en tationof
Ha inanm yc inproduc ingstra in
ZhouChaohu i, W uYan, DongL ei, YeH u i and W uJ im in
(Shangha iIn st itu teo fM a te r iaM ed ica,Ch ine seA cadem yo fScience s, Shangha i200031)
ABSTRACT H igh2p roducingm u tan t s227andY81ofha inanm ycinw ereob ta inedbyionbeamim p lan ta2
t iono rp ro top la stregenera t ion.N it rogenandca rbonsou rcew erestud iedfo rp roduct ivityofst ra inY81.T heu2
n ifo rmdesignm ethodw a sadop tedbetw eent iterandfou rcom ponen t sofferm en ta t ionm ed iumtoselecttheop2
t im umcond it ion.Fo rst ra inY81,theop t im a lt iterinshakerofferm en ta t ionw a sover3000m g L.
KEYWO RD S H a inanm ycin; Ionbeamim p lan ta t ion; M u ta t ion; Ferm en ta t ion
31 中国抗生素杂志1999年2月第24卷第1期
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