推广 热搜: 万古霉素  酵母  谷氨酸发酵  发酵  发酵罐  维生素  胰岛素  蛋白酶  阿维菌素  柠檬酸 

万古霉素发酵液凝聚与絮凝研究

   日期:2011-01-12     来源:发酵工业网    作者:发酵网    浏览:1843    评论:0    
  

【摘要】 对凝聚与絮凝法预处理万古霉素发酵液的工艺进行了研究,初步选用三种凝聚剂、三种絮凝剂,以滤速、沉淀物重量、滤液澄清度、滤液中万古霉素含量以及万古霉素液相色谱峰面积占总积分面积百分比为指标,考察凝聚剂与絮凝剂的作用效果。从中选择偏铝酸钠、壳聚糖,并详细研究其用量、pH对预处理效果的影响,结果显示偏铝酸钠为较合适的凝聚剂。进一步讨论了搅拌时间对凝聚效果的影响,通过正交试验确定了最佳凝聚工艺条件为:pH4,偏铝酸钠用量750mg/L,搅拌时间6min。

【关键词】 万古霉素 偏铝酸钠 壳聚糖 凝聚 絮凝

Study on coagulation and flocculation of vancomycin fermentation broth

ABSTRACT Coagulation and flocculation process of vancomycin fermentation broth were studied. Three coagulants and three flocculants were chosen to examine their effects on the pretreatment process. The factors including filtration rate, precipitation weight, filtrate clarifying level and vancomycin concentration in the filtrate were considered. Sodium meta?aluminate and chitosan were selected. The effects on the pretreatment by coagulant/flocculant concentration and pH value were studied in detail. Sodium meta?aluminate was considered to be a suitable coagulant. Further experiments were carried out to study how the stirring time effected the coagulation. The optimal coagulation process condition was obtained by orthogonal design experiment and the parameters were determined as follows: pH4; concentration of sodium meta?aluminate, 750 mg/L; stirring time: 6 min.

KEY WORDS Vancomycin; Sodium meta?aluminate; Chitosan; Coagulation; Flocculation

万古霉素是一种糖肽类抗生素,由微生物发酵法生产,是治疗由金葡球菌引起的严重感染的首选药物之一,临床上多使用其盐酸盐。万古霉素发酵液预处理技术对后续分离纯化工艺操作以及产品的收率和质量有较大的影响,目前国内、外针对此工艺的报道较少。 凝聚和絮凝能有效改变细胞及溶解大分子物质的分散状态,使其聚结成较大的颗粒,提高过滤速率,有效除去杂蛋白和固体杂质,提高滤液质量[1]。凝聚与絮凝方法操作简便易行,能耗低,所用设备及药品成本低廉,与超滤等其它方法相比较,有独特的优势,符合国内实际情况,是工业上常用的发酵液预处理方法。

凝聚作用是指在某些电解质作用下,使扩散双电层的排斥电位降低,破坏胶体系统的分散状态,使胶体粒子聚集的过程[2]。本研究使用的硫酸铝、氯化铁、偏铝酸钠(NaAlO2)是常用的凝聚剂,也有报道用偏铝酸钠对循环冷却水进行处理效果较好[3]。

絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂作用下,悬浮粒子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大的絮凝团的过程[2]。本研究使用的聚丙烯酰胺、聚乙二醇、壳聚糖是常用的絮凝剂,其中壳聚糖是一种天然无毒的有机高分子絮凝剂,国内有很多关于用壳聚糖处理发酵液的研究[4~6]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 万古霉素发酵液由本实验室提供;硫酸铝、氯化铁为天津市化学试剂三厂产品;偏铝酸钠天津大学化工厂(配成26%水溶液)提供;聚丙烯酰胺为天津市元立化工有限公司(配成1%水溶液)产品;聚乙二醇由天津市四通化工厂(配成1%水溶液)生产;水溶性壳聚糖由天津市光复精细化工研究所(配成0.5%水溶液)提供。所用试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器

JA21002型电子天平为上海精天电子仪器有限公司产品;pHS?3CW微机型酸度计为上海理达仪器厂产品;205型自动磁力搅拌器由美国VWR公司提供;SHB?B 95型循环水式多用真空泵由郑州长城科工贸有限公司生产;DFG801型电热鼓风箱为湖北黄石医疗器械厂产品;SSI?PC2000型高效液相色谱仪为天津兰博实验仪器设备有限公司产品。

1.3 实验方法

(1)凝聚、絮凝 取40ml发酵液置100ml烧杯中,调节pH值,加入凝聚剂或絮凝剂,搅拌,于100ml量筒中静置2h。

(2)抽滤 吸取静置后的上层发酵液20ml弃去,将剩余发酵液摇匀,抽滤,测滤速,以单位时间抽滤所得滤液体积计算,并观察滤液清亮程度。

(3)沉淀物重量测定 将滤饼干燥称重,减去干燥滤纸空重,计算沉淀物重量。

(4)万古霉素含量测定 将抽滤所得滤液稀释五倍,用高效液相色谱法[7,8]测定万古霉素含量。

2 结果与讨论

2.1 凝聚剂与絮凝剂的初步筛选

(1)凝聚剂与絮凝剂的加入对原始发酵液预处理效果的影响 原始万古霉素发酵液的pH值约为8.9,按照经验用量加入不同凝聚剂与絮凝剂,作用效果明显(表1)。加入凝聚剂与絮凝剂后,滤速、沉淀物重量、万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比以及滤液澄清度均有不同程度的提高;除加入聚乙二醇的试样外,其它试样滤液中万古霉素含量变化不大,这可能是由于含聚乙二醇的试样在絮凝过程中形成的一些絮凝团吸附、包含了少量的万古霉素,使其在抽滤时留在了滤饼中。

(2)凝聚剂与絮凝剂的加入对不同pH值发酵液预处理效果的影响 为检验凝聚剂与絮凝剂在不同酸碱条件下的作用效果,将发酵液分为三等份,分别调节pH值为3.0、7.0、10.0,凝聚剂与絮凝剂用量不变,结果见表2。

由表2可知,pH值对预处理效果有一定的影响,酸性条件下的作用效果稍好。就一种凝聚剂或絮凝剂而言,pH值的变化对万古霉素含量影响并不大。

经过上述两个实验的比较,初步选择偏铝酸钠、壳聚糖进行后续的实验。

2.2 偏铝酸钠用量对凝聚效果的影响

表3表明,偏铝酸钠的用量影响凝聚效果。其添加量介于500和2000mg/L时滤速较大,沉淀物重量以及万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比在750mg/L时用量时达到最大值,滤液澄清度也随着偏铝酸钠用量的增加有所改善,而滤液中万古霉素含量则稍有降低,这可能是由于过量的凝聚剂吸附了发酵液中微量的万古霉素。综合考虑,选择750mg/L为较适用量。


2.3 pH值对偏铝酸钠凝聚效果的影响

发酵液pH值对凝聚效果的影响见表4。表4结果显示,pH值的变化对絮凝效果有比较明显的影响。酸性条件下的滤速明显比中性及碱性条件下的滤速大,滤液澄清度较高;空白样的沉淀物明显较少,万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比也较低,提示加入偏铝酸钠能有效去除发酵液中的杂质。空白样还显示,在不同pH值条件下加入一定量的凝聚剂对万古霉素的产量并无较大影响。综合考虑,选择pH值为4。 表1 凝聚剂与絮凝剂的加入对原始发酵液预处理效果的影响表3 不同偏铝酸钠用量对凝聚效果的影响表4 不同pH值对偏铝酸钠凝聚效果的影响

pH值345678910空白1空白2滤速(ml/min)9.959.618.046.456.195.335.816.292.695.95沉淀物重量(g)0.720.790.770.760.740.800.770.760.490.75滤液澄清度 - 滤液万古霉素含量(g/L)2.492.512.512.502.502.472.482.492.492.47万古霉素HPLC峰面积占40.8743.9643.0742.6441.7444.39〖〗43.0942.6330.6842.18 总积分面积的百分比(%)

用量750mg/L,搅拌3min; 空白1:未调pH,未加偏铝酸钠; 空白2:未调pH,加偏铝酸钠。 :较澄清; :澄清; -:浑浊。2.4 壳聚糖用量对絮凝效果的影响

由表5可知,体系中壳聚糖的用量影响絮凝效果。增大絮凝剂的用量有助于充分发挥架桥作用,使胶粒絮凝,但用量过多反而会引起吸附饱和,胶粒表面被壳聚糖高分子覆盖,使体系恢复稳定状态,所以随着壳聚糖用量的增加,滤液中万古霉素含量有所下降。从滤液澄清度来看,加入壳聚糖的滤液均不如加入偏铝酸钠的滤液清亮,絮凝物重量也明显低于用偏铝酸钠时的沉淀物重量,且万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比也普遍较低。综合各项指标,选择600mg/L的用量进行下一步实验。

2.5 pH值对壳聚糖絮凝效果的影响

如表6所示,酸性条件下的絮凝效果优于碱性条件,从空白样可以看出,在不同pH值条件下加入适量的壳聚糖对万古霉素含量影响不大。由于使用壳聚糖处理发酵液的整体效果仍然不如偏铝酸钠,故选择偏铝酸钠进行进一步实验。

2.6 搅拌时间对偏铝酸钠凝聚效果的影响

搅拌时间对凝聚效果的影响见表7。滤速、沉淀物重量以及万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比随搅拌时间的增加先增大后减小,搅拌时间在6min时效果较好,说明如果搅拌时间太短,凝聚剂与溶液中的胶粒无法充分接触,达不到凝聚效果,但若搅拌时间过长,则凝聚在一起的胶粒又会被打散,影响凝聚效果。

2.7 偏铝酸钠凝聚最佳工艺条件的确定

为选择最佳的凝聚工艺条件,在单因素实验的基础上设计了正交实验,选用三因素三水平正交实验,以 表5 不同壳聚糖用量对絮凝效果的影响 表6 不同pH值对壳聚糖絮凝效果的影响表7 搅拌时间对偏铝酸钠凝聚效果的影响pH4,用量750mg/L,各个试样滤液均较澄清。万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比为主要检测指标。其因素水平表、实验结果表及方差分析表见表8、表9和表10。由正交实验结果可知,pH值对凝聚效果影响最显著,用量次之,搅拌时间对凝聚效果影响不显著。最表8 正交试验因素水平表表9 正交试验结果表10 方差分析表来源离差自由度均方离差F值显著性A25.612 212.806 81.56 显 著B6.885423.442721.926显 著C3.963121.981512.62 不显著误差QE0.31420.157总和QT36.774 8

佳凝聚条件为A2B2C2,即pH4,偏铝酸钠用量750mg/L,搅拌时间6min。经验证,此条件下的凝聚效果较好,滤速10.51ml/min,沉淀物重量达0.90g,滤液较澄清,万古霉素HPLC峰面积占总积分面积的百分比达到48.82%,万古霉素浓度为2.50g/L。

2.8 万古霉素分离纯化工艺简述

凝聚后的发酵液经过XAD?16大孔树脂纯化,所得洗脱液中万古霉素液相色谱峰面积可达总积分面积的85.61%,万古霉素浓度达到8.93g/L。洗脱液经活性炭脱色、真空旋转蒸发浓缩、添加丙酮结晶、真空冷冻干燥等工序制得成品,纯度达95%以上。

3 结论

针对万古霉素发酵液预处理工艺,从六种凝聚剂与絮凝剂中选出偏铝酸钠和壳聚糖进行研究,发现偏铝酸钠作用效果较壳聚糖好。通过进一步实验,摸索出最佳凝聚工艺条件为pH4,偏铝酸钠用量750mg/L,搅拌时间6min。


【参考文献】
[1] 毛忠贵. 生物工业下游技术[M]. 北京:中国轻工业出版社,1999:41

[2] 顾觉奋. 分离纯化工艺原理[M]. 北京:中国医药科技出版社,2000:10

[3] 田颖. 偏铝酸钠处理循环冷却水及配伍使用研究[J]. 工业水处理,2003,23(8):17

[4] 刘清华,钱和,张伟国. 用絮凝法处理L?异亮氨酸发酵液[J]. 加工技艺,2004(11):54

[5] 程丽,梁金钟. 絮凝法预处理大豆蛋白活性肽发酵液的研究[J]. 大豆通报,2004(2):17

[6] 沈金玉,熊训浩,刘元帅. 絮凝与膜超滤耦合预处理谷氨酰胺发酵液[J]. 精细化工,2002,19(11):675

[7] Sztaricskai F, Borda J, Puskas M M, et al. High performance liquid chromatography of antibiotics of vancomycin type [J]. J Antibiot,1983,36(12):169

[8] 陈代杰,李继安,邹韵华,等. 万古霉素的研究开发[J]. 中国抗生素杂志,2004,29(1):8

 
     
    更多>同类技术资料
    0相关评论

    推荐图文
    推荐技术资料
    网站首页  |  2024年发酵工业网第12期电子月刊  |  设备维修  |  关于我们  |  联系方式  |  付款方式  |  广告合作  |  网站地图  |  排名推广  |  广告服务  |  积分换礼  |  网站留言  |  RSS订阅  |  违规举报  |  鄂ICP备2024036847号-1
    Powered By DESTOON