β-胡萝卜素(β-ｃａｒｏｔｅｎｅ)的稀溶液呈鲜艳的橙黄色,是一种优良的色素,在人体和动物体内可以转化为维生素Ａ,同时还有较强的抗氧化功能,因此兼具有较高的营养价值和药用价值。目前广泛应用于食品、药品、化妆品、和保健品行业[1]。天然β-胡萝卜素可以从富含β-胡萝卜素的植物和藻类中提取,但是这种方法受产地、自然条件等限制,产量有限。三孢布拉霉(Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ)在培养过程中不需要光照,生物量大,能大量产生β-胡萝卜素,目前在俄罗斯、乌克兰等国已实现了工业化生产[2]。但是三孢布拉霉发酵工艺复杂,不稳定,产量低是目前存在的主要问题,本文在发现了一种简便的孢子培养方法的基础上,尝试了以孢子接种的种子培养方式,并优化了接种量、正负菌的最适接种比例,提出了在种子培养阶段,正负菌孢子混合培养,二级种子培养的工艺。比较了各种氮源对发酵产量的影响,并用正交设计法优化了培养基。经改进后的工艺比较稳定,β-胡萝卜素的产量达到1.39ｇ/Ｌ。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种
三孢布拉霉(Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａ)正菌,负菌,上海化工研究院菌种室保存。
1.1.2 培养基
活化培养基:ＰＤＡ。
种子培养基(ｇ/Ｌ):大豆粉67.5ｇ,玉米粉37.5ｇ,加入0.4ｍｏｌ Ｌ硫酸675ｍＬ于121℃水解30ｍｉｎ,水解液于室温下保存,使用时以1:1的比例加水调匀,氢氧化钠调节ｐＨ至6.3～6.8,121℃,灭菌30ｍｉｎ。
发酵培养基(ｇ/Ｌ):玉米淀粉69ｇ,蛋白胨5.6ｇ,异烟肼0.6ｇ,豆油56ｍＬ,脱臭煤油20ｍＬ,以及其它微量组分,ｐＨ6.3～6.8,121℃灭菌25ｍｉｎ。
1.2 方法
1.2.1 发酵过程
将培养好的种子液或孢子接入发酵培养基,27℃,220ｒ ｍｉｎ培养至140ｈ结束。
1.2.2 菌体干重
将发酵液抽滤得到的湿菌体,在80～90℃中烘干至恒重。
1.2.3 β-胡萝卜素的测定
(1)标准曲线的绘制:精确称取β-胡萝卜素50ｍｇ,加少量氯仿溶解,用石油醚稀释至50ｍＬ,分取此液1ｍＬ,用石油醚稀释至100ｍＬ,此液每ｍＬ含β-胡萝卜素10μｇ,此液用时新鲜配制。吸取β-胡萝卜素标准液0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8ｍＬ分别以石油醚定容至10ｍＬ,在波长450ｎｍ处分别测定其光密度,绘出标准曲线。
(2)将样品放于研体中,加入1:1的丙酮石油醚混合液,研磨抽提,反复抽提至样品完全无色,将提取液稀释至适当倍数,以石油醚为参比,于450ｎｍ处比色,与标准曲线比较,计算出β-胡萝卜素含量。
1.2.4 孢子计数
血球计数法。
2 结果
2.1 孢子直接接种
2.1.1 接种量的影响
将正负菌孢子以1:1比例,不同接种量接种于发酵培养基中,培养140ｈ后测定β-胡萝卜素产量和干菌体量。
接种量会影响菌体的形状[3],一般而言,丝状形态或极小的菌球形态均有利于氧气和营养物质的传递,接种量在2.0×105-1.0×106之间的菌体呈松散的丝状,当接种量降至4.0×104时菌体呈极细小的球状,但接种量高至1.0×106时在发酵后期会出现严重的溶菌现象,而接种量降至0.8×103时菌球直径显著增加,这些因素引起菌体量和产量下降,从以上结果可以看出孢子接种量在4.0×104～2.0×105之间产量最高且变化不大,所以取1.0×105的接种量进行后续研究。
2.1.2 正负孢子比例的影响
正负菌孢子以不同的比例,以1.0×105的接种总量,接入培养基,培养140ｈ测定产量见表2。
正菌或负菌单独培养时只能产生很少量的β-胡萝卜素,当它们一起混合培养时β-胡萝卜素产生产量可增加几十倍,然而正负菌比例对β-胡萝卜素的产量有显著的影响,适宜的接种比例是发酵工艺中需要确定的一个重要参数,从以上结果可以看出正负菌孢子的比例以1∶2为最佳。
2.1.2 孢子直接接种法的在生产中存在的问题
孢子直接接种法简便,在实验室规模中能够得到良好的结果。但是,孢子接种量需要达到1.0×105 50ｍＬ培养基,如果假定此工艺将在10吨发酵罐中进行,装料系数为70%,则需要总量为1.4×1010个孢子的接种量,如此大量的孢子在生产上是难以培养的。
2.2 二级种子培养方法
为了使工艺在实际生产中可行,我们研究了种子扩大的工艺,通常采用的工艺都是在种子培养阶段正负菌分别培养,再以一定比例同时接种于发酵液中进行混合发酵,这样需要两个种子罐,而且因为正负菌的最适接种比例为1∶2,这样需要采用不同大小的种子罐,或同样大小的种子罐采用不同的装液量等措施,增加了操作的复杂度,能否在种子阶段就使正负菌混合,培养一定时间后,以此种子液接种发酵培养基?对此,我们参照前期研究的最适接种量和接种比例,比较了这两种种子培养方法。
Ａ:正菌负菌孢子分别以1.0×105 50ｍＬ接种量接种种子培养基,培养48ｈ,正负菌1:2的比例混合以10%接种量接种发酵培养基,继续培养至140ｈ。
Ｂ:正负菌以1:2比例,总量1.0×105 50ｍＬ接种种子培养基培养48ｈ,以10%接种量接种发酵培养基,继续培养至140ｈ。
结果:Ａ法β-胡萝卜素产量为1.18ｇ Ｌ,Ｂ法为1.07ｇ Ｌ,由此表明,在种子阶段,正负菌混合培养与分开培养相比产量并无明显下降,但是从生产的角度考虑混合培养要简便得多,故我们决定采用在种子阶段,正负菌混合培养的种子培养工艺。
2.3 培养基的优化
2.3.1 各种有机氮源的影响
将原培养基中的蛋白胨替换为0.6%的其他氮源结果如表3。
蛋白胨、黄豆饼粉、玉米浆都是有利于产生β-胡萝卜素的氮源。以黄豆饼粉作氮源,β-胡萝卜素产量最高,而且其价格低,来源广,在制药工业中广泛使用,故我们选择黄豆饼粉作为培养基的氮源。
2.3.2 正交试验优化培养基
2.3.2.1 实验设计
对培养基中的各成分比例进行了优化,以玉米淀粉,黄豆饼粉,酵母膏,异烟肼,豆油,煤油作为优化对象;其中豆油和煤油之间的比例不变(56:20)而将它们的总量作为一个因素来考虑,每个因素选四个水平,不设误差列,不考虑交互作用,选Ｌ16(4 5)表,列表及其结果如表4、表5。
由于正交表中所有列都被因子占据了,没有估计误差的空白列,便以各列偏差平方和中最小(此处为酵母膏的)的近似看作误差的估计,自由度看成∞[4]。
2.3.2.2 最优培养基配方分析
从极差分析和方差分析得出,在所考察的因素中:黄豆饼粉对产量有着显著影响,异烟肼,豆油、煤油混合液有一定影响,酵母膏和玉米淀粉则无显著影响。最佳条件为:Ａ4Ｂ3Ｃ2Ｄ1Ｅ4
2.3.2.3 最优培养基配方的验证
选取了理论最优配方,及正交试验中产量最高的两个条件Ａ4Ｂ2Ｃ3Ｄ1Ｅ4,Ａ4Ｂ3Ｃ2Ｄ4Ｅ1条件作对比性实验,结果如表7。
此验证结果表明:Ａ4Ｂ3Ｃ2Ｄ1Ｅ4条件产量最高为最优化配方,即每1000ｍＬ发酵培养基含黄豆饼粉12ｇ,玉米淀粉70ｇ,酵母膏3ｇ,异烟肼0.4ｇ,豆油66.4ｍＬ,煤油23.6ｍＬ以及其它微量组分等。
2.4 工艺条件稳定性试验
在获得最优培养基配方后,对整个工艺的稳定性进行了考察,重复三批次试验结果如表8。
结果表明整个工艺有着良好的稳定性,平均β-胡萝卜素量达到1.39ｇ/Ｌ。
3 结语
(1)改进后的种子培养流程为:正负菌孢子1:2,总量1.0×105个 50ｍＬ混合接种种子培养基培养48ｈ后,以10%接种量接种发酵培养基。优化发酵培养基为:每1000ｍＬ发酵培养基含黄豆饼粉12ｇ,玉米淀粉70ｇ,酵母膏3ｇ,异烟肼0.4ｇ,豆油66.4ｍＬ,煤油23.6ｍＬ以及其它无机盐等。改进后的工艺比较稳定,平均β-胡萝卜素量达到1.39ｇ/Ｌ。
(2)采用菌丝体接种的工艺时,各试验批次之间波动很大,其中很大一部分原因与无法控制接种量及正负菌的接种比例有关。采用孢子接种时,孢子能被计数,可以定量,种子液的浓度和正菌、负菌之间的比例可以通过控制接入种子液的正菌、负菌孢子的数量、比例以及控制孢子在种子液中的萌发时间来达到,这样的工艺条件相对稳定,在种子培养阶段,正负菌孢子混合培养的也大大简化了工艺条件,优化发酵培养基后进一步提高了产量。改进后的工艺条件在1吨罐规模中试中采用,并取得了良好的效果。
