维生素Ｃ(Ｖｃ)二步发酵的第二步为混菌发酵,使Ｌ-山梨糖合成Ｖｃ前体2-酮基-Ｌ-古龙酸(ＫＧＡ)。最初筛选的混菌体系为氧化葡萄糖酸杆菌与条纹假单孢杆菌的组合,前者为产酸菌(俗称小菌),后者不产酸,但可促进前者产酸,也称伴生菌;1988年,宁文珠等以巨大芽孢杆菌代替条纹假单孢杆菌获得成功,后经不断改进,目前生产上大多使用的混菌体系为巨大芽孢杆菌和小菌的组合,使糖酸转化率已由最初的39 7%(糖浓度7%,6ｄ)提高到79 5%[1]。本文以掷孢酵母代替巨大芽孢杆菌与小菌组成新的混菌体系,并对环境因子与产酸关系进行了探索,旨在揭示二步发酵机制,指导生产。
1 材料与方法
1.1 菌株掷孢酵母(Ｓｐｏｒｏｂｌｏｍｙｃｅｓｒｏｓｅｕｓ)Ｙ44,由中科院生态研究所菌种室提供。巨大芽孢杆菌(Ｂａｃｉｌｌｕｓｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ)和氧化葡萄酸杆菌(Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒｏｘｙｄａｎｓ)2980,由东北制药总厂提供。
1.2 培养基采用掷孢酵母、氧化葡萄糖酸杆菌及巨大芽孢杆菌适合培养基[2,3]。
1.3 分析方法
1.3.1 生长曲线的测定:光密度法[4]。
1.3.2 ＫＧＡ含量的测定:碘量法[5]。
1.3.3 残糖的测定:蒽酮试剂法[6]。
2 结果与分析
2.1 通气量对发酵的影响
不同通气量的设定是在6组相同体积(300ｍ1)摇瓶中装有不同体积的发酵液,进行发酵,结果见表1所示。可以看到摇瓶中通气量的允许范围还是比较大的,其中以25-35ｍ1装液量产酸较高,35ｍｌ转化率最高,25ｍ1次之。从规律上看,通气量的增加使ＫＧＡ积累量增加,但通气量过大反而产酸量降低,这可能是因为通气量过大使混合菌中二菌生长不协调,掷抱酵母与氧化葡萄糖酸杆菌最适比例破坏,从而使ＫＧＡ积累量下降。
进一步对三组不同装液量的发酵摇瓶(表2)每4ｈ取样,测定菌浓,作生长曲线如图1、图2,从图可见,随着通气量增加,掷抱酵母生长加快,且适应期缩短,消亡期滞后,同时氧化葡萄糖酸杆菌生长也加快,且各生长期随通气量增加而提前,但过大通气量对氧化葡萄糖酸杆菌生长反而抑制,这可能由于通气量过大造成掷抱酵母生长过盛,打破二菌间协作机制,从而相对抑制氧化葡萄糖酸杆菌生长;影响通气量因素还有摇床的转速大小,不能用转速太低的摇床。
2.2 温度对发酵的影响
设定5组不同温度的实验(其它条件相同),进行发酵,结果如表3所示。选取其中三个温度(24℃、28℃、32℃,表4),将新组合菌系与现有菌系产酸作一比较,同时分别作出掷抱酵母与氧化葡萄糖酸杆菌在发酵过程中生长曲线,见表5、图3、图4。
注:山梨糖浓度为8%,发酵液体积30ｍｌ(300ｍｌ摇瓶)
从表3、表5看出,与现有菌系相比,新组合菌系发酵产酸,耐受温度范围较宽,其中以28℃左右为最适,产酸量最高,转化率也最高。
图3、图4显示,温度升高有利于掷抱酵母生长,但温度过高不利于氧化葡萄糖酸杆菌生长,温度降低,掷抱酵母生长减慢,氧化葡萄糖酸杆菌生长也减慢。
3 结论
综上所述,新组合菌系产酸温度范围为24-32℃,28℃左右为最适,与现有菌系相比,可适应温度范围拓宽;新混菌体系发酵过程中通气量不同直接影响到二菌比例,进而影响到ＫＧＡ的积累,适当增加通气量,有利于二菌生长,利于二菌间协调,以25-35ｍｌ装液量(300ｍｌ摇瓶,180ｒ/ｍｉｎ)为最适,高于或低于此范围,产酸量下降。
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