微生物具有非常丰富的酶系统,有强大的分解、转化物质的能力"用微生物发酵中药,可能对中药化学成分进行生物转化,产生新的化合物或引起中药中一些成分含量的变化"另外,微生物发酵中药的过程中,中药中的一些成分可能诱导微生物的某些代谢途径发生变化,从而产生新的化合物"这些都将为活性化合物的筛选提供丰富的资源"微生物发酵中药应成为中药研究的新内容".实验中,用枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)对包括人参!西洋参!红参!党参等在内的50种中药进行发酵,检测了他们的发酵产物对结核分支杆菌(My2cobacteriumtuberculosis)和榛色青霉菌(Penicilliumavellaneum)的抑制作用,结果表明微生物与中药之间是相互作用的,因为部分中药的发酵产物抗菌活性增加,而部分中药的发酵产物抗菌活性降低,原因可能是一方面中药诱导菌体产生更多的活性物质或菌体产生的抑菌物质与中药中的抑菌活性成分一起产生更强的抑菌作用以及微生物将中药中的部分非抑菌物质转化为活性的化合物,而另一方面,菌体可能对中药中的抑菌活性成分进行转化生成非活性成分,导致发酵产物活性降低"这些都表明发酵产物的成分与原料比较发生了变化"
1 材料和方法
1.1 材料 菌株:结核分支杆菌(M1tuberculosis)保存于云南省生物资源保护与利用重点实验室;榛色青霉菌24376(P1avellaneum)保存于中国科学院昆明植物研究所"
中药:葛根!鸦胆子!芦根!淡豆豉!牛蒡子!苍耳子!火麻仁!炒栀子!黄连!白蔹!草豆蔻!莲子!龟板!建菖蒲!杏仁!白芷!茯苓!草果!升麻!连翘!苦参!土茯苓!银柴胡!防己!苏子!香附!槟榔!山楂!芦子!柏子仁!延胡!女贞子!五味子!枸杞!小红参!重楼!党参!当归!白毛根!西青果!车前子!锁阳!人参!西洋参!天麻!白附片!半夏!射干!王不留行!桑椹子共50种中药购买自昆明市药材市场"
1.2 方法 发酵:将中药切片剪碎后,各取5g于50ml的三角瓶内,加入30ml自来水,121度灭菌30min,"每瓶加入在麦芽汁培养基中培养了48h的枯草芽孢杆菌菌液1.5ml,30度静止培养10天"同时做三种对照,一种用麦芽汁培养基代替自来水加入到中药里,另一种为中药里加入麦芽汁培养基,但不接种枯草芽孢杆菌,第三种为枯草芽孢杆菌的正常发酵"即有四组实验:中药+水+菌;中药+培养基+菌;中药+培养基;培养基+菌"样品处理:不同中药的发酵物及各组对照培养10天后,每一个样品中加入30ml甲醇提取,滤纸过滤,滤液浓缩干后用甲醇溶解,将甲醇溶解物取出过滤到样品瓶内,定容至5ml使用时直接取100uL进行活性检测"抑菌实验(纸片扩散法):取200uL活化12~16的结核分支杆菌液涂布于直径为9cm的牛肉膏蛋白胨培养基平板中,直接在涂布有病原菌的培养基上放上含有测试样品的纸片,37度培养"24h后,观察是否有抑菌圈生成"有抑菌圈生成的测量抑菌圈的直径(包括纸片直径0.6cm)"榛色青霉UC-4376接榛色青霉菌uc-4376接入培养皿中培养至大量孢子形成后,用吐温80将孢子洗下,制成孢子悬液,加入到榛色青霉菌固体培养基中,制成榛色青霉平板"将含100uL样品的纸片挥干溶剂后放置榛色青霉平板上,42度培养,36h观察结果,测量抑菌圈大小"
2 结果
观察不同中药各组处理的样品所做的抑菌实验结果,有抑菌圈产生的测量抑菌圈的大小,没有抑菌圈生成的认为该处理在此剂量下没有抑菌作用,抑菌圈直径小于0.7cm的认为只有微弱活性"抑菌实验结果表明,槟榔!白芷!当归!牛蒡子!茯苓!桑椹子!龟板!防己!草果!芦根!锁阳!红参!枸杞!银柴胡和天麻15种中药的各种处理对结核分支杆菌和榛色青霉菌都没有明显抑制作用;黄连!西洋
表1 发酵前后抑菌活性不变的中药
-标示没有抑制作用,下表皆同"
参!建菖蒲!射干!柏子仁5种中药的各种处理对两种病原菌都有不同程度的抑制作用,香附!连翘!土茯苓!白附片和人参的同一处理对这两种菌也具有抑制作用;有的中药的各种处理只对结核分支杆菌有抑制作用,如苦参!山楂!淡豆豉!半夏!草豆蔻"从以上结果可知,中药中存在有抗菌活性成分的种类较多,有的活性较强,如已知的抗菌药黄连对细菌和真菌!建菖蒲对细菌!芦子对真菌都具有较强的活性,从中药中寻找抗菌活性成分是可行的"
枯草芽孢杆菌的正常培养提取物对两种病原菌都有微弱的抑制作用(表1),经微生物发酵后的中药提取物对病原菌的抑制作用可分为以下几种情况:
1).部分中药的各种处理都没有抑菌活性或抑菌活性不变,如前面提到的15种不具有抑菌作用的中药以及黄连!山楂!半夏!草豆蔻,部分原因可能是枯草芽孢杆菌在部分中药上不能生长(表1);
2).有的只有在接种枯草芽孢杆菌的处理中出现抑菌活性或接种枯草芽孢杆菌的处理中活性高于未接种的中药
表2 发酵后抑菌活性增强的中药
提取物,如连翘!白附片!苏子!西青果!芦子!王不留行,可能是菌体在中药上生长并产生了抑菌活性成分,使其抑制作用强于中药单纯提取物,有的活性高于菌体正常发酵的提取物,说明中药成分对菌体产生抑菌活性成分有诱导作用,或菌体与中药本身的抑菌成分一起增强了抑菌作用,或菌体将中药中的部分非抑菌成分转化为活性成分,且有的在第二组处理,即加培养基和中药接种菌体的处理中抑菌活性更强,可能是加入培养基更有利于菌体的生长,从而产生更多抑菌活性成分的缘故,如射干!淡豆豉!芦子!柏子仁!杏仁!火麻仁(表2);
3).1有的中药在接入菌体的处理中抑菌活性低于未接菌中药的处理,如西洋参!白茅根!苦参!建菖蒲!人参!车前子!葛根!白蔹以及炒栀子的抑制细菌活性,原因可能是菌体将中药中的部分抑菌活性成分转化为非抑菌活性成分的缘故(表3);
4).有的中药的发酵结果无规律,如香附!重楼!五味子!女贞子!苍耳子!延胡!莲子!鸦胆子!党参以及升麻抑制细菌的活性(表4),对这些结果还没有合理的解释,但可能与样品处理过程中造成的误差有关"
3 讨论
以上实验表明,微生物在大部分中药中均能生长,说明中药能提供微生物生长的必需营养条件和生理调节因子"以抑菌活性为指标,结果表明部分中药发酵后活性提高,可能是由于中药化学成分对微生物产生抑菌活性成分有诱导作用,或微生物将中药的非活性成分转化为抑菌活性成分,或者微生物分解了中药中可能促进微生物生长的生理调节因子,这三种途径都将可能导致发酵产物抑菌活性的增强,另外,也不能排除微生物化学成分与中药成分有协同抑菌作用"除增效作用以外,实验也表明,部分中药的发酵产物活性降低,可能是中药中的部分抑菌成分被微生物转化为非活性成分"因此,微生物对中药的发酵结果是不同的,既能增效,也能降低活性,或者不变,说明中药经微生物发酵后成分发生了变化,这些可为活性化合物的筛选提供丰富的资源,微生物在中药中的应用是可行的"
参考文献
[1]王兴红,李旗德,曹秋娥1微生物发酵中药应成为中药
研究的新内容1中草药,2001,32(3):26722681
(2005-08-01收稿)
