利用微生物发酵、动物细胞培养生产基因工程药物是目前工业化生产基因工程药物的最主要方法。工程菌发酵培养主要包括育种技术、发酵过程的优化等。其中良好的生产菌种是发酵工作的中心环节。在传统的发酵工业中,菌种的诱变和筛选工作起着非常重要的作用。在七·五期间,国家发展高技术产业确定后,基因工程技术(重组DNA技术)为发酵工程开辟了广阔的领域。生物技术产品作为优先开发的领域之一,给我国生命科学领域带来了一场深刻的革命,科学家们利用基因操作技术克隆出目的基因,然后将其组装入表达质粒,转染到宿主细胞中,经过发酵诱导表达目的产物以及纯化等一系列程序生产出所需要的目的产物。特别是医疗用蛋白、多肽类治疗药物的研制和开发在全国已蓬勃兴起,时至今日,已有多种蛋白、多肽类药物研制成功并应用于临床。诸如重组大肠杆菌表达生产人干扰素,白细胞介素和人生长激素以及集落刺激因子等。然而要实现基因工程工业化生产,除了要构建高效的载体-宿主系统外,基因工程菌的发酵过程控制也是十分重要的。
1 工程菌菌株的选择
大肠杆菌是比较经济的表达系统,所以目前的基因工程产品有很多是采用重组大肠杆菌表达的。大肠杆菌(E.coli)作为真核基因的表达宿主,有其遗传背景清楚,技术操作简便,培养条件易控制,大规模发酵成本低等特点。适宜的发酵工程菌株除有高浓度、高产量、高产率外,还应满足下列要求:①能利用易得的廉价原料;②不致病,不产生内毒素;③容易进行代谢调控;④易于进行重组DNA技术。应用基因工程受体菌以E.coli研究得最多。目前已构建成功多种高效表达系统。原先只能从人或动物体内提取的蛋白现在许多都能在E.coli中高效表达。但在某些因素影响下,细胞内表达的最大问题就是容易形成不溶性的包涵体,它的形成对表达产物的活性不利。
包涵体(inclusionbody)是细菌表达的蛋白质在胞内互相凝集而形成的无活性固体颗粒。具有很强的折光性。包涵体的形成,目前尚无结论。然而正常的大肠杆菌基因以重组方法使其在大肠杆菌内表达也会形成包涵体。说明不仅仅是外源蛋白才能形成包涵体,同时也发现有表达量较低的基因产物也是以不可溶形式存在的。包涵体的形成不仅仅与宿主细胞、表达基因有关,还与培养外环境有关系。其形成的原因多数认为:目的基因的过度表达使蛋白质无足够时间进行肽链折叠,产生凝集。重组蛋白所处的环境条件对包涵体也有较大影响,如当温度超过某一种蛋白质的变性温度时,随着温度的增加凝集量也增加。当环境PH接近某一种蛋白的等电点时,蛋白的凝集增加,包涵体的形成也增多,此外,离子组成和强度、辅助因子、氧化还原电位等均可影响包涵体的形成。了解包涵体形成的影响因素是很重要的,在实际操作中为避免或减少包涵体的出现,可以通过改变发酵条件,如发酵温度、培养的PH值等来减少重组蛋白的凝集,进而有效控制包涵体的形成,给下游纯化工作创造有利条件。
2 发酵工艺的优化
发酵过程为工程菌提供一个优化的物理及化学环境,使工程菌能更好的生长繁殖,得到更多需要的生物量,从而合成更多的目的产物。好的工程菌株和良好的培养环境是发酵成败的关键。工程菌生长繁殖需要的条件是:①良好的物理环境:主要有发酵温度、PH值、溶氧量等。②合适的化学环境:适宜工程菌生长代谢所需的各种营养物质的浓度,并限制各种阻碍生长代谢的有害物质的浓度。在发酵过程中许多控制参数对工程菌的生长构成影响,需不断加以调整,所以其条件数据要加以分析处理,从而达到优化控制目的,见表1。
3 基因工程菌常用的发酵方法
3.1 批式培养
这种培养方法的操作比较简单。批式培养是指营养物和工程菌株一次加入进行培养,直到培养结束放出,中间除了空气进入和尾气排出、酸碱调解PH值外与外部没有物料交换。传统的生物制品发酵多用此过程。这种培养方法由于发酵罐本身的温度、PH值、搅拌、空气流量多为自控,操作简单。但从细菌所处的化学环境看则时刻都在发生变化,不能使细菌自始至终处于最优条件,因为培养的初期,培养基中营养物过多,接种的细菌量较少,可能会抑制工程菌的生长,培养的中后期可能又因为营养物的逐渐耗尽和细菌代谢抑制物的积累而降低培养效率。从细胞的增殖来看,初期细胞浓度低,增长慢,后期细胞浓度虽高,但细胞逐渐停止分裂,以致老化衰亡,设备的生产能力不是很高。
3.2 流加式培养
流加式培养技术(FedbatchTechnique)是一种发酵过程中优化化学环境的一种有效方法,在批式培养基础上,改善批式培养过程中由于营养物质的消耗造成的重组细胞营养不足,调整了工程菌所处的生长环境,使工程菌一直处于最佳状态,见表2。
从表2中可见流加式培养比批式培养在干扰素活性方面都有明显提高。流加培养的特点就是能够调解培养环境中营养物质的浓度,一方面它可以避免某些营养成分的初始浓度过高而出现底物抑制现象,另一方面,能防止某些限制性营养成分在培养过程中被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成[8],这就是流加式操作与批式操作的明显不同。此外,营养物质补充的量和补加的最佳时间及流速,这要求我们在实际的操作中去摸索数据来完成,而且还要注意整个过程中反应体积的变化,这也是流加培养的一个重要特征。
3.3 发酵工艺的程序控制
随着生物技术的发展,计算机技术的进步,目前越来越多的运用计算机技术对发酵过程进行精细化的研究,对工程菌的生长条件进行优化,设计出适宜工程菌发酵的程序,可大大提高工程菌菌体的产量和表达量,实践证明应用工程菌发酵工艺的程序控制使操作更简便、工艺更稳定且节省人力,见表3。
手控调节搅拌转速和通气量可导致工程菌生长环境的突然改变。而程序控制可自动调节工程菌生长环境的最佳条件,其环境变化温和、平稳,有利于工程菌的生长和表达。构建高效表达的工程菌和优化最佳培养条件是工程菌高密度发酵和重组产物表达的重要条件。因此发酵工艺和条件的优化是发酵工作的一项重要内容,两者是相辅相成必不可少的,掌握这两种技术再加上发酵过程中参数的优化,发酵工程的前景是极为乐观的。
