利用基因工程酵母发酵生产外源蛋白质已有不少文献报道，但通过发酵工程研究改善产物产率的研究鞍少 j。本文利用2L搅拌发酵罐培养一株表达a淀粉酶的基因重组酵母，对营养物流加方式及溶解氧浓度影响发酵产率进行研究，在发酵工程方面寻找提高a淀粉酶分泌表达水平有效途径，期望对利用重组酵母体系生产外源蛋白质有参考作用。
1 材料与方法
1 1 菌株
表达、分泌型载体pNA3，其中含有SUC2启动子．Killer 28k信号序列和PGK终止子等基因片段．小白鼠唾液淀粉酶基因作为目的基因被插在信号序列和终止子之间。该重组质粒含有2 um 质粒的复制起始部位(ori)和选择性标志(TRP1)。pNA3质粒被形质转换人酵母S．cerevisiae的分泌变异株20B一1 2中，得到的基因重组体S．cerevisiae 20B-1 2tpNA3)。
1．2 培养基
天然成分培养基(YPD)用作活化菌种。组成：酵母膏10 g／i ，蛋白胨10 g／L．葡萄糖2og I ：pH6．o 以上葡萄糖为国产分析纯试剂．其余为国产生化试剂。半合成选择性培养基(SSM)用作菌种保藏、质粒稳定性测试及摇瓶培养。
组成：葡萄糖适量，酵母基础氮(Yeast Nitrogen Base w／o Amino Acid)适量，维生素B 10mg／L，维生素 1 mg／l，，生物素0．1 mg／I ，肌醇5mg／I⋯D 泛酸钙10 mg／I ；pH 6．0。以上酵母基础氨为Sigma公司产品，其余同YPD培养基。全合成选择性培养基(SM)用作细胞增殖。组成：葡萄糖5g／l ，(NH )2sO 适量，KH POI2 g／i K HPOt 1 g／i ，KC1 2 g／l ，NaC1 0．1 g／I，．H3BO30．5 mg／I ，MnSO。·H?O 10 mg／I ，ZnSO‘·7H2O 2 mg／I ，CuSO‘·5H 2O l mg／l ，Na￡MoO 4·2H 0 2 mg／1 ，维生素B 10 mg／I ，维生索l mg／L，生物素0．1 mg／l ，肌醇5 mg／L，D一泛酸钙10 mg／l ，FeSO{·7H2O 50 mg／L；MgSO‘·7H2O1 g／l ，CaCI2 50 mg／l ；pH 6．0。其中FeSO ·7H O，Mg SO ·7H O．CaC1 分别灭菌。此培养基配成补料浓缩底物用于生长期补料。无机盐和葡萄糖为国产分析纯试剂．其余为国产生化试剂。半合成非选择性培养基(sUM)用作生成菌落．除SSM 所有成分外．再添加色氨酸，pH 6．0 培养基均于0．1 MPa压力下灭菌10 min2 实验结果与讨论
2．1 生长期基本营养物的补料方式
提高增殖期菌体浓度，是增加产酶期目的产物分泌表达量的重要基础。分别采用恒流量流加和基于指数关系的脉冲流加方式，流动添加基本营养物，探讨对菌体增殖及基因产物表达的促进作用 实验结果如图l，2 由结果可见，基于指数关系的脉冲式流加方式无论在菌体增殖还是表达水平方面都要好于恒流量流加。其原因可能是指数流加符合菌体生长对营养的需求 ]
2 2 溶解氯浓度的影响
由于酵母增殖和蛋白质合成需要大量能量，而氧是微生物呼吸及底物生物氧化所必须的，故发酵罐的通气十分重要 图3，4是培养过程溶解氧浓度、菌体浓度及表达水平随培养过程的变化。培养过程保持较好的通气状态，最终菌体浓度8．6 g／L，最大酶活为1 5 vmol／(min·mI )，比活力为l9．80~mol／(rain·mg)，可见，施加良好的通气，对菌体浓度的提高起到正向作用；通气充足时产生的淀粉酶活力比通气不佳时高出2至3倍之多(数据未给出)。其原因可能在于合成代谢需要氧的供给，即供氧有助于同化代谢。本实验基本保持溶解氧浓度高于临界溶解氧浓度“ ，使菌体浓度和酶活都有较大提高。
3 结论
1)基于指数关系的脉冲流加方式符合菌体生长对营养的依赖，有利于增加菌体浓度并提高基因表达水平。
2)通气充足，对菌体增殖和产酶有非常显著的促进作用。
