干扰素(Interferons)是一类具有多种生物学活性的小分子多肤，在机体抗病毒、抗肿瘤及增强免疫功能上具有重要作用。其中INF- a型在临床治疗上具有重要价值(11。侯云德等[IZl在中国人基因组中克隆到INF-a lb，并成功研制了我国第一个拥有自主知识产权的重组基因工程细胞因子。然而，INF-a-lb在大肠杆菌中表达并不理想，且发酵密度低，纯化工艺复杂。为此，我们通过优化干扰素基因在大肠杆菌中的翻译调控，构建了高表达菌株(文另发)，本文在此基础上，研究了该菌株的高密度发酵及分离纯化方法，建立了稳定、可行的适用于规模化生产的工艺。
材料与方法
1.INF-alb表达菌种
菌种由上海生物制品研究所细胞及分子生物学研究室构建，表达质粒PAM采用T7启动子，含卡那霉素抗型基因，大肠杆菌宿主菌为JM109 (DE3)。
2.试剂
蛋白陈购自日本大五营养化学株式会社，酵母粉购自英国。xoid公司，磷酸盐、氯化钠、盐酸、氢氧化钠、葡萄糖等系国产AR级试剂，工PTG购自Takara公司。DEAE Sepharose Fast Flow, CM Sepharose Fast Flow, Sephecryl S一100均购自Amersham Pharmacia Biotech公司。
3.主要仪器
BioFLO IIC型5L发酵罐(New Brunswick Scientific公司),Biostar100L发酵罐(B. Braun公司)，Mini P.工工凝胶电泳仪(Bio-Rad公司)。
4.发酵培养
将经常规检定后保存于-70℃的PAM/JM100(DE3)工作代甘油菌种，转种到含50ug/ml卡那霉素的50m1 LB培养基，37℃，200rpm, 16h后作为发酵第一代菌种，按1:300转接LB(含50ug/ml卡那霉素)，3790, 200rpm 6h，到A600 1.8左右作为发酵用第二代菌种，菌种按1:25接种发酵罐，自动控制溶氧 (DO)在30%,pH6.7左右，37℃培养至A600 1.5，加人诱导剂IPTG使终浓度为2mM,
补料后继续培养6一7h，离心收菌。
5. INF- a1b的纯化
按1000g发酵菌体加40L升((4℃ )PB缓冲液的比例，均匀悬浮细菌后，以50一60KPa匀浆2次，离心，取上清.上已平衡的DEAF Sepharose Fast Flow层析柱，流速60ml/min，以含100mM NaCI的缓冲液洗涤杂蛋白，再用含500mM NaCl的缓冲液洗脱，收集蛋白峰。洗脱液经稀释、调整pH后上CM Sephrose Fast Flow，流速60ml/min，用pH4.0醋酸盐缓冲液洗脱，收集蛋白峰，经超滤浓缩，用Sephecryl S-100分子筛作最后分离，流速l0ml/min，收集到的蛋白主峰即为INF- alb。
6.干扰素的检定
活性测定按WISH细胞法[[3]，蛋白测定按Lowry法[[3]，纯度、等电点、分子量等项目均按《中国生物制品规程》进行检定。
结果
1.工程菌的发酵
在细菌对数生长初期，进行诱导控制，干扰素一般在诱导3h后开始表达(图1)，在诱导后的6h至7h左右活性达到高峰。不同诱导时间干扰素的活性变化和细菌生长曲线基本一致，尤以100L罐更明显，见表1、图1和图2。
在5L, 100L发酵罐各进行了3批高密度发酵试验。在5L罐中，细菌密度.平均在37(A600)，表达水平在20%左右。在100L罐中，发酵密度和表达水平分别为70( A600)和30%，明显高于5L罐，见表1和图2。
