作者：庹晓晔, 柴家科, 蒋伟, 常东, 盛志勇
【关键词】 人β防御素3；,细菌膜穿透增加蛋白；,融合表达；,毕赤酵母
Fusion expression of human βdefensin 3 and bactericidal/permeability increasing protein in P. pastoris
【Abstract】 AIM: To investigate the possibility of fusion expression of human βdefensin 3 (hBD3) and bactericidal/permeability increasing protein (BPI) in P. pastoris. METHODS: DNA fragments encoding hBD3 mature peptide and BPI were linked via a Linker sequence and cloned into yeast expression vector pPICZαB followed by introduction into P. pastorisX33 by electrical transduction. Positive clones identified by genomic PCR and phenotype analysis were induced by methanol for protein expression. In supernatants, recombinant protein was purified by phenyl sepharose high performance and source 30Q ionexchange columns. Western Blot against hBD3 and BPI was performed respectively to identify the recombinant protein. RESULTS: Recombinant pICZαBhBD3BPI was proved correct by restriction analysis and sequencing. X33pICZαBhBD3BPI clone expressed the recombinant fusion protein in SDSPAGE electrophoresis after induction for 24 h. The protein product was both hBD3 and BPIpositive. A purity of 89% was reached after purification procedures. CONCLUSION: Its feasible to express hBD3 fused to BPI in P. pastoris yeast expression system.
【Keywords】 human βdefensin 3; bactericidal/permeability increasing protein; fusion expression; P. pastoris yeast
【摘要】 目的：探讨采用酵母表达系统进行人β防御素3（hBD3）与细菌膜穿透增加蛋白(BPI)融合表达的可行性. 方法：将hBD3成熟肽基因通过Linker蛋白与BPI基因串联，克隆于酵母表达载体pPICZαB中，电转导入X33毕赤酵母菌，经重组酵母基因组PCR和表型鉴定获得阳性克隆，对阳性克隆进行甲醇诱导表达，上清进行目的蛋白纯化和Western Blot鉴定. 结果：重组载体经酶切和测序证实序列正确，重组X33pICZαBhBD3BPI克隆经甲醇诱导24 h后,上清SDSPAGE电泳显示有目的蛋白表达，Western Blot分析表明重组蛋白抗人hBD3和BPI均阳性，该目的蛋白依次通过疏水色谱、离子交换色谱纯化，蛋白纯度达到89％. 结论：采用毕赤酵母系统融合表达hBD3和BPI是可行的.
【关键词】 人β防御素3；细菌膜穿透增加蛋白；融合表达；毕赤酵母
0 引言
抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的小分子多肽，具有强碱性、热稳定性以及广谱抗菌等特点，是解决细菌抗生素耐药性的希望［1］. 某些抗菌肽对部分真菌、原虫、病毒及癌细胞等也具有强力的杀伤作用，因而这类活性多肽被命名为多肽抗生素［2-4］. 防御素是抗菌肽的一种，其中人β防御素3（hBD3）主要分布于人的皮肤和粘膜的上皮细胞，具有广谱的抗菌活性，尤其是对包括金黄色葡萄球菌在内的革兰阳性菌具有强烈的杀伤作用，构成人类抵御病菌侵袭的一道有力的化学屏障；同时还发现，hBD3具有重要的免疫调节作用［5-7］. 杀菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability increasing protein,BPI)是目前发现的唯一既能非特异性杀伤革兰阴性菌，又能中和内毒素，同时具有免疫调理等作用，加强中性粒细胞对细菌的吞噬作用的抗菌物质. 我们采用酵母表达系统对hBD3与BPI融合蛋白进行表达，以期获得抗菌肽基因工程开发的新途径.
1 材料和方法
1.1材料
P. pastoris表达载体pPICZαB,宿主菌P. pastoris X33, 蜗牛酶,抗生素ZeocinTM (Invitrogen公司); BPI成熟肽基因由珠海宏昱生物技术有限公司蒲勤博士赠送; 酵母氮碱干粉和DSorbitol (Amnesco公司)；预染蛋白质分子质量标准品(Sigma公司)；兔抗hBD3多克隆抗体和鼠抗人BPI mAb,羊抗兔IgGAP (abcam公司);荧光素酶试剂盒(Promega公司); BCA蛋白定量Kit (Pierce公司)；限制酶等试剂购自Takara，New England Biolabs.
1.2方法
PCR引物设计： P1: 5′GCCGCGGATGAGGATCCATTATCTTCTG3′(含SacII位点)； P2: 5′CCTTTCTGAGAGATACGCATGGAGGCGGAGGCTC
AGTCTTTCTTCGGCAGCAT TTTCGGCC3′ (编码Linker的序列GGGGS)； P4: 5′GCAAATGGCATTCTGACATCC3′； P5: 5′GACTGGTTCCAATTGACAAGC3′； P3: 5′GCCTCTAGATTAGAAGAAACAGAGTTGG3′(含XbaI位点). 以pGEMTEasyhBD3质粒［8］作为模板，用引物P1，P2进行PCR反应获得hBD3Linker片段,再以该片段为5′端引物，以P3为3′端引物扩增BPI序列. 获得约750 bp片段后，回收，纯化，用SacII消化后，T4 DNApolymerase削平3′末端，灭活后再以XbaI消化,得到一平一粘末端，pPICZαB载体进行相同处理后与片段按1∶3比例进行连接. 转化大肠杆菌DH5α，Zeocin抗性平板筛选，酶切鉴定，得重组pPICZαBhBD3BPI克隆. pPICZαBhBD3BPI质粒以SacⅠ酶切线性化后电转导入P. pastoris X33宿主菌，方法按EasyselectTM Pichia Expression Kit操作说明进行. 各取转化细胞200 μL均匀涂布于含500 mg/L，1000 mg/L，2000 mg/L Zeocin的YPD平板，30℃静置培养. 提取含2000 mg/L Zeocin的YPD平板上阳性克隆的基因组DNA，以其作为模板，P4，P5为引物进行PCR反应检测目的基因整合情况. 分别挑取含有2000 mg/L Zeocin的YPD平板上的2个克隆，接种于MD，MM培养板的相应位置上，并接种试剂盒中所提供的Mut+，Mut-酵母细胞，分别作为阳性和阴性对照，置30℃恒温箱培养至克隆形成. 参照阳性、阴性对照，对比同一位置克隆大小，确定表型. 将Mut+ P. pastoris转化子单菌落接种BMGY 25 mL培养基，30℃振荡培养至A600为2~6，离心收集细胞，重悬于BMMY 100~200 mL中，继续培养. 每24 h补加甲醇1次，至终浓度为1 g/L，同时取培养上清进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达. 收集培养液上清，加入固体（NH4）2SO4至65%饱和度，4℃放置30 min后离心收集沉淀，沉淀以10 mmol/L TrisCl (pH=9.8), 1.5 mol/L NaCl溶解后，样品上phenyl sepharose high perfomance柱进行疏水层析，再经Source 30Q柱进行阴离子层析纯化，收集并合并目的蛋白峰. 纯化蛋白电泳后进行Western Blot分析. 一抗为兔抗hBD3多克隆抗体(1∶500)或鼠抗人BPI mAb(1∶50).蛋白定量采用BCA蛋白定量试剂盒.
2 结果
2.1pPICZαBhBD3BPI重组质粒的鉴定
由pGEMTEasyhBD3质粒中扩增出hBD3序列，再以该产物为5′端引物扩增BPI序列，得到hBD3BPI序列，两者之间以编码GGGGS 5个氨基酸的Linker序列连接. 该序列通过两端设计的SacII和XbaI酶切位点插入到pPICZαB的相应多克隆位点，获得pPICZαBhBD3BPI. 小量提取质粒以KpnI， EcoRI和SacII+XbaI消化，切下预期大小片段,分别约270, 400和770 bp. 同时，测序结果也证明所克隆hBD3BPI序列完全正确，且按设计方向准确进入表达载体.
2.2融合蛋白的表达和纯化
随机选取2个Mut+克隆，酵母基因组PCR反应均扩增出与预期结果大小一致的特异条带，证明所获得克隆有目的基因成功整合. 甲醇诱导表达至96 h后，重组克隆的培养上清中出现了与hBD3BPI融合蛋白预期分子质量一致的新生蛋白条带(图1A)，显示重组克隆可能以分泌形式表达了hBD3BPI. Western Blot结果也显示hBD3和BPI均为阳性（图1B）. 酵母诱导上清中所含目的蛋白可被65％饱和硫酸铵充分沉淀，复溶后依次通过疏水色谱，离子交换色谱,目的蛋白得到进一步纯化，最终薄层扫描结果显示目的蛋白纯度达到89％(图1C).
3 讨论
天然抗菌肽水溶性好,大部分具有热稳定性,在100℃加热10~15 min仍能保持其活性，部分抗菌肽具备抵抗胰蛋白酶或胃蛋白酶水解的能力. 在迄今发现的人类抗菌肽中主要是防御素类，其中hBD3因对革兰氏阳性菌，尤其是金黄色葡萄球菌具有强有力的杀伤作用且不会产生耐药性而具有开发为新型抗生素的巨大潜力. 随着近年来对hBD3研究的不断深入，不仅发现hBD3具有更广泛的抗菌谱，还具有重要的免疫调节功能，在机体的天然免疫中发挥着重要作用，尤其是其对肿瘤细胞、乙肝病毒、HIV病毒的杀伤作用.
我们采用酵母表达系统融合表达hBD3和BPI. 该设计的优势在于：①hBD3BPI融合蛋白产物以可溶性的方式分泌表达. 毕赤酵母表达的外源蛋白既可积累于胞内也可分泌至胞外. 在很多情况下，只要简单采用Invitrogen公司商业化的表达载体，如本研究中用到的pPICZαB载体，即可获得分泌型表达. ②与BPI的融合增加了产物的抗菌谱，也提高了对酵母基因组的利用率，相对提高了产量. BPI是一种很有希望成为新型抗菌药物的物质［9］. 将两者以GGGGS柔性Linker蛋白连接、融合后，其产物将对革兰氏阳性和阴性菌都具有杀伤作用，可谓“强强联合”，使之成为“超级抗生素”. ③易于纯化. 由于毕赤酵母的自身蛋白分泌水平很低，因此，培养基中总蛋白的绝大部分是分泌表达的外源蛋白. 从这一点来说，将外源蛋白分泌至培养基中完全可看做是蛋白质纯化的第一步. ④提高了产量. 由于融合蛋白不需要切割、分离，减少了后续操作，因此目的蛋白的产量也得到了显著的提高.
【参考文献】
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