摘 要 阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平[1,2]。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清[3]。产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素
1.1宿主菌的选择
不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌[4]。表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性[5]。因此,不同宿主菌的选择对表达产物的积累以及下游分离纯化都有至关重要的作用。
1.2质粒载体
重组大肠杆菌中构建的质粒载体对外源基因的表达也产生了很大影响。常用的基因表达载体有ｐＥＴ、ｐＳＣ、ｐＰＢＢ、ｐＵＣ系列以及由它们衍生的一系列优化载体。
质粒载体的拷贝数和稳定性不仅受宿主菌生理状况及生长环境的影响,而且还取决于自身的遗传特性。质粒载体的拷贝数并不是越高越好,因为有些克隆的编码基因,当用高拷贝数质粒作载体时,其产物含量过高会严重地扰乱寄主细胞正常的新陈代谢活动。质粒不稳定性通常有以下两种情况1)分离不稳定性;(2)结构不稳定性。另外环境条件也会影响质粒的拷贝数,如葡萄糖、ＮＨ4+等因子的限量供应以及ｐＨ的变化都会引起质粒拷贝数的下降。已有报道通过正交实验考察了Ｅ.ｃｏｌｉＨＢ101(ｐＢＲ322)高密度培养过程中,不同培养条件对质粒的稳定性影响,结果表明当温度在33～39℃、ｐＨ为6.4～7.2、ＤＯ为40%～80%时质粒没有丢失现象[6]。
2 培养条件
2.1营养源
高密度发酵要获得高生物量和高浓度表达产物,需投入几倍于生物量的基质以满足细菌迅速生长繁殖及大量表达基因产物的需要[7]。一般使用的培养基为半合成培养基,培养基各组分的浓度和比例要恰当,过量的营养物质反而会抑制菌体的生长,特别是碳源和氮源的比例。葡萄糖(Ｇｌｕ)因细菌利用快且价廉易得,已被广泛用作重组菌高密度发酵的限制性基质。一般Ｇｌｕ浓度控制在10ｇ/Ｌ左右,如果超过20ｇ/Ｌ将会抑制细胞的生长。同时已有人用甘油代替Ｇｌｕ作为细菌生长的碳源,以减少代谢抑制物质———乙酸的积累,更易达到重组菌的高密度和外源蛋白的高表达。ＮＯ3-、胰蛋白胨(Ｔｒ)、酵母提取物(Ｙｅ)作为氮源有利于细胞的生长。比如,在硅藻类(Ｎｉｔｚｓｃｈｉａｌａｅｖｉｓ)高密度培养过程中提高十二碳五烯酸ＥＰＡ的产量时,ＮＯ3-∶Ｔｒ∶Ｙｅ的最佳比例为1∶2.6∶1.3,Ｇｌｕ∶ＮＯ3-的最佳比例为32∶1[1]。有些营养物质在高密度培养过程中可以控制细胞的死亡率,曾有报道在非洲绿猴肾成纤维细胞系(ＶＥＲＯｃｅｌｌ)培养过程中,加入半乳糖和谷胱甘肽可以阻止细胞程序性死亡[8]。
另外还有实验数据表明,在培养基中加入重组蛋白表达的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高。比如利用重组大肠杆菌生产谷胱甘肽(ＧＳＨ)时,在发酵开始和进行12ｈ后,各添加2.0ｇ/Ｌ腺苷三磷酸(ＡＴＰ)和9ｍｍｏｌ/Ｌ前体氨基酸,可以使细胞浓度和ＧＳＨ的产量分别比不添加这两种物质提高24%和1.4倍[9]。2.2 控制条件
2.2.1 接种量 接种量大小的控制对很多细胞培养和代谢物积累都起到重要作用[10]。接种量对基因表达的影响不大,但对菌体生长影响较明显。接种量小(0.5%～4%)时,比生长速率大,对数生长期持续时间长;接种量大(>8%)时,细菌较快地达到了稳定期,持续生长时间短,自溶也较快,所以接种量一般选择在4%以下[11]。
2.2.2 溶氧浓度 溶氧浓度是高密度发酵过程中影响菌体生长的重要因素之一。大肠杆菌的生长代谢过程需要氧气的参与,溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大,溶解氧的浓度过高或过低都会影响细菌的代谢。在高密度发酵过程中,由于菌体密度高,发酵液的摄氧量大,一般通过增大搅拌转速和增加空气流量以增加溶氧量。随着发酵时间的延长,菌体密度迅速增加,溶氧浓度随之下降。因此在高密度发酵的后期,需要维持较高水平的溶氧浓度。 目前,提高溶氧量的方法主要有:通入纯氧来提高氧的传递水平,但可能导致局部混合不匀,易使微生物氧中毒;在菌体中克隆具有提高氧传递能力的透明颤藻蛋白(ＶＨＢ)[12];培养基中添加Ｈ2Ｏ2,利用宿主菌的过氧化氢酶分解产生Ｏ2;提高氧的分压[13]。
2.2.3 ｐＨ值 稳定的ｐＨ值是使菌体保持最佳生长状态的必要条件。由于外界的ｐＨ值变化会改变菌体细胞内的ｐＨ值,从而影响细菌的代谢反应,进而影响细胞的生物量和基因产物的表达。Ｅ.ｃｏｌｉ发酵时产生的有机酸(主要是乙酸)可导致发酵液的ｐＨ值降低,细胞释放的ＣＯ2溶解于发酵液内与Ｈ2Ｏ作用生成的碳酸也会导致发酵液ｐＨ值的降低。在高密度发酵条件下,细胞产生大量的乙酸和ＣＯ2,可使ｐＨ值显著降低。必须及时调节ｐＨ值使之处于适宜的ｐＨ值范围内,避免ｐＨ值激烈变化对细胞生长和代谢造成的不利影响。 菌体生长和产物合成过程中,常用于控制ｐＨ的酸碱有ＨＣｌ,ＮａＯＨ和氨水等,其中氨水常被使用,因为它还具有补充氮源的作用。但有研究发现,ＮＨ4+浓度对大肠杆菌的生长有很大影响,当ＮＨ4+浓度高于170ｍｍｏｌ/Ｌ时会严重抑制大肠杆菌的生长。
2.2.4 温度 培养温度是影响细菌生长和调控细胞代谢的重要因素。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,低温培养能提高重组产物的表达量,而且在不同培养阶段采用不同的培养温度有利于提高细菌的生长密度和重组产物的表达量,并可缩短培养周期。但细胞生长的温度突然升高细胞内就会生成某些热激蛋白,以适应变化的环境,外源蛋白相对量降低,给后续的纯化造成困难。如果温度升高的范围不太大,热激蛋白合成的速度会很快下降,恢复正常蛋白的合成。对于采用温度调控基因表达或质粒复制的重组菌,发酵过程一般分为生长和表达两个阶段,分别维持不同的培养温度。但也会因为升温而引起质粒的丢失,而减少重组蛋白量。
2.2.5 诱导剂及诱导时间控制 乳糖基因(ｌａｃ)及其衍生的启动子被广泛地应用于重组蛋白在大肠杆菌表达系统中进行表达生产。这类启动子通常都用异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)作为诱导剂进行外源蛋白的表达,但它成本高,污染环境,因而不适于工业生产。已有人用乳糖代替异丙基 β Ｄ 硫代半乳糖苷(ＩＰＴＧ)做为诱导剂[14]或者以一定比例混合[15],诱导外源蛋白的表达。 诱导剂的添加量及诱导时菌体密度的高低都会影响到外源蛋白的表达水平。浓度较低时,外源蛋白的表达水平随着诱导剂浓度的升高而不断升高;当浓度超过一定限度时,就会影响菌体代谢及蛋白表达水平。 诱导时间的选择也是影响外源蛋白表达的一个重要因素。一般控制在菌体的对数生长期或对数中后期。
2.2.6 补料控制 重组大肠杆菌高密度发酵成功的关键在于补料策略,即采用合理的营养流加方式。常用的流加模式[5]:非反馈补料,反馈补料,其主要工作原理见下表。
除了补料技术的影响外,补料培养基成分及补料时间的选择对外源基因的表达也是至关重要的。如在大肠杆菌表达重组绵羊生长激素(ｒ-ｏＧＨ)时,补料培养基的成分就包含有Ｇｌｕ和Ｙｅ,并在培养16ｈ后进行补料[16]。
3 生长抑制因子
3.1 乙酸的积累 以Ｇｌｕ为碳源的大肠杆菌的生长,常伴随着乙酸的分泌,进而影响细胞生长和蛋白表达。乙酸的分泌可以通过维持较低浓度的Ｇｌｕ或补充Ｙｅ等来减少合成代谢。当残留的Ｇｌｕ浓度<1ｇ/Ｌ和乙酸浓度<2ｇ/Ｌ时,不存在大肠杆菌细胞生长的抑制因子[17]。 乙酸的产生与细胞中的电子传递链和三羧酸循环有关。目前国外已有研究希望通过代谢工程改变重组大肠杆菌的代谢途径,从而降低乙酸的生成。
3.2 ＣＯ2的积累 高密度发酵过程中,细菌代谢产物ＣＯ2的积累也会抑制外源蛋白的表达[18]。因为ＣＯ2对菌体具有直接的毒害作用,而且溶解于发酵液中也会导致ｐＨ值的下降。有报道多变鱼腥藻(Ａｎａｂａｅｎａｖａｒｉａｂｉｌｉｓ)[19]可以利用ＣＯ2为碳源,进行高密度培养,这样可以消除ＣＯ的抑制作用。
4 发展与展望 随着发酵控制手段的进一步发展,临控技术的掌握,发酵装置在线检测或控制物理化学参数、化学测量、生物学和生化测量,并提供反映环境变化和细胞生长的许多重要信息,作为控制发酵过程的依据。生物反应器也有了巨大的发展,比如膜反应器就可以透析除去发酵液中有害物质,从而实现工程菌的高密度发酵。
基因工程菌高密度发酵技术是基因工程技术生产应用的基础,其产品在化工、食品、环保、医药等方面都存在极大的潜在能力。但能否实现高密度培养及高目标产物浓度,是工程菌能否以较低成本实现规模生产的决定性因素。因此,必须结合高密度发酵的各个工艺条件,简化操作工艺,降低工业成本,最终使目标产物生产的规模化和产业化得以实现。
