蜘蛛是地球上最古老的物种之一,经历了远比人类进化历史长的约4亿年的历史,蜘蛛已能够适应几乎所有生存环境,这种广泛适应性的关键在于其独特的纺丝能力。蜘蛛拖丝构成蛛丝网框的骨架,对拖丝的物理和机械特性的研究结果显示,拖丝的拉伸断裂强度比同直径的钢材还大,与制造防弹背心的材料—高强度对位芳香族聚酰胺纤维Kevlar处于同一等级。此外,拖丝还表现出优异的弹性(断裂伸长35%)。由于拖丝的拉伸强度和适宜的弹性最适宜的结合,拖丝所具有的强固性和柔韧性是其它合成纤维材料很难同时比拟的[1]。基于蛛丝极佳的材料性质,其作为组织工程生物材料显现出极大的应用潜力[2~4]。
蜘蛛丝纤维的本质是蛋白质,与蚕丝相反,要获取大量的蜘蛛丝并非易事,基因工程为以蛋白质为基础的基因克隆和表达提供了有效的途径。自1995年解决了重复序列片段的构建困难之后,利用拖丝蛋白的部分cDNA片段和人工合成拖丝蛋白部分基因,分别报道了在大肠杆菌、毕赤酵母和转基因植物等体系表达式的培养的结果,所获得的表达产物量是有限的[5~10]。我室构建了含细胞黏附位点精甘天冬(RGD)三肽—蜘蛛拖丝蛋白基因重组工程菌pNSR-16(全文另发表),以此作为细胞外基质的活性类似物,研究其作为细胞培养支架材料对细胞的吸附、分化及促进细胞生长的能力。为规模化制备大量的RGD-重组蛛丝蛋白,这里我们报道通过摇瓶培养实验确定pNSR-16基因工程菌表达的优化条件,在此基础上进行发酵罐高密度培养,建立蛛丝蛋白基因工程菌高密度发酵工艺。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株 表达重组RGD-蛛丝蛋白基因的工程菌pNSR-16(宿主菌BL21(DE3)pLysS)为本室构建。
1.1.2 主要仪器 电泳仪Mini-PROTEANIII为BIO-RAD产品,GBCS-10B/1型发酵罐购自镇江东方生物工程设备技术公司。
1.1.3 培养基LB培养基(g/L) 胰蛋白胨10,酵母粉 5,NaCl 5,pH7.0。发酵培养基[11](g/L):葡萄糖5,酵母汁5,(NH4)2HPO4 4,KH2PO4 13.3,柠檬酸1.7,MgSO4·7H2O 1.2,微量元素溶液(10ml/L),pH7.0。微量元素溶液(g/L):FeSO4·7H2O 0.1,CaCl2·2H2O 0.02,ZnSO4·7H2O 0.0225 MnSO4·4H2O 0.005,(NH4)6MoO·4H2O 0.001 Na2B4O·H2O 0.0002,CuSO4·H2O 0.01。补料培养基(g/L):葡萄糖600,MgSO4·7H2O 20,酵母汁100。
1.2 摇瓶培养方法
pNSR-16菌株活化后将单菌落接种到含30ug/ml卡那霉素和34ug/ml氯霉素的LB培养基中,37℃培养过夜,以1%接种量接入到含相同抗生素LB培养基,培养至一定菌体密度,加入异丙基-BD-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。
1.3 发酵培养方法
1.3.1 一级菌种制备 pNSR-16菌株活化后单菌落接入到含30ug/ml卡那霉素和34ug/ml氯霉素的LB培养基中,37℃,200rmin培养7~8h。
1.3.2 二级菌种制备 取一级种子,以2%接种量接入到含30ug/ml卡那霉素和34ug/ml氯霉素的发酵培养基中,37℃,200rmin培养过夜。
1.3.3 GBCS-10B/1型发酵罐中分批补料培养 取二级种子,以4%接种量接入到含30ug/ml卡那霉素和34ug/ml氯霉素的发酵培养基中,37℃,进行分批补料培养。细菌接种培养4h后,以10ml的速度开始流加补料培养基,随后流加速度以1mlh逐渐递加。37℃培养14h,于30℃加入IPTG诱导6h。
1.4 分析方法
1.4.1 确定菌体浓度 分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD600)。
1.4.2 重组蛛丝蛋白表达产物的分析 取适量的
菌体离心,加热变性后,进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳,经考马斯亮蓝染色1h,脱色,可见清晰的蛋白条带。
2 结果与讨论
2.1 诱导剂IPTG浓度对表达量的影响
已鉴定重组RGD-蛛丝蛋白基因工程菌pNSR-16表达产物分子量约为60KD。培养菌体至一定浓度,以诱导剂IPTG不同浓度进行诱导。IPTG的浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmolL,培养4h。根据图1分析表达产物在可溶性蛋白中的含量,当IPTG浓度较低时,表达量随着IPTG浓度的增加而提高,但到0.6mmol/L以后,表达量增加并不明显,由此确定IPTG的最适浓度为0.4mmol/L。
2.2 诱导时间对表达量的影响
在确立IPTG浓度的基础上,试验了不同时间对产物表达量的影响(见图2)。随着诱导时间的增加,重组蛛丝蛋白的表达量逐渐提高,诱导6h时达到最高表达量,占总蛋白的21.8%。延长诱导时间,表达量不再增加,这可能是由于诱导时间过长易出现蛋白降解。
2.3 诱导前菌体浓度对表达量的影响
在菌体生长的不同阶段加入IPTG进行诱导,培养4h。从图3可以看出,当菌体浓度OD600在0.2~0.8之间时,随着菌体浓度的增加,目的蛋白表达量亦增加。OD600为0.8时,目的蛋白表达含量可达23.4%。若诱导前菌体浓度再增加,却不利于目的蛋白表达。分析原因认为这可能是由于培养基被消耗或菌体慢慢老化,因此在高密度发酵时可以通过分批补料培养,增加新鲜培养基,来保持菌体活性和提高目的蛋白表达量。
2.4 前体物甘氨酸和丙氨酸对产物表达的影响
有实验表明,在培养基中加入重组蛋白表达产物的前体氨基酸和一些能量物质有利于蛋白表达量的提高[12]。由于重组蛛丝蛋白甘氨酸和丙氨酸比例含量较高,因此考虑添加适量的这两种氨基酸以会提高蛋白表达量。从表1可以看出,加入甘氨酸和丙氨酸有利于蛋白表达,而且不影响菌体生长。
2.5 温度对产物表达的影响
培养温度不仅影响细菌生长和细胞代谢调控,而且可影响载体质粒的稳定性和复制效率。较高的温度有利于细菌的高密度发酵,而低温培养能促进提高重组产物的表达量,因此可以在不同阶段采取不同的培养温度。表2总结出诱导温度在30℃时,重组蛛丝蛋白表达量最高。
2.6 pH值对产物表达的影响
外界pH值的变化会改变菌体细胞内的pH值,从而影响细菌的代谢反应,进而影响细胞的生物量和基因产物的表达。进行了最适pH值实验,从图4可以看出,pH值偏碱时产物表达最少,pH值过酸时也不利于产物表达,pH7.0左右有利于重组蛛丝蛋白表达。
2.7 基因工程菌pNSR-16分批补料高密度发酵
2.7.1 高密度发酵溶解氧的确定 在高密度发酵过程中,由于菌体密度高,发酵液的摄氧量大,因此必须提供足够的溶解氧。分批补料培养结果表明,当溶氧浓度过高时,可能会引起菌体氧中毒;当溶氧浓度过低时,则不利于菌体生长和蛋白表达,因此确定溶解氧浓度控制在40%~50%。发酵前期通过增加转速来提高溶氧,发酵后期通过通入纯氧提高溶氧。
2.7.2 高密度发酵pH值的控制 菌体培养至对数生长期,发酵液的pH值降低,这可能是由于培养基的快速消耗,发酵液中积累了有机酸。自动流加30%氨水,使pH保持在7.0。
2.7.3 分批补料高密度发酵 在GBCS-10B/1型发酵罐中进行高密度发酵的培养条件如表3所示。
pNSR-16菌株的生长曲线和比生长速率曲线(见图5)。
0~4h,细菌生长缓慢处于延滞期,在此期间发酵培养基中的营养成分消耗比较慢,所以不流加补料。
4~14h,细菌生长旺盛,比生长速率最高可以达到0.565h-1。4h后菌体密度开始有所提高,溶解氧浓度下降比较快,并且开始有自动流加氨水,这一现象反映出细菌生长旺盛,营养物质消耗快,所以开始以10ml/h的速度流加补料。由于添加了新鲜营养成分,细菌始终保持在较高的生长活性状态下,快速生长。随着菌体密度的不断增加,补料培养基的流加速度也要随之提高,最后确定以10ml/h的速度递增补料量。14~20h,14h添加终浓度为0.4mmol/LIPTG和0.1%甘氨酸丙氨酸,并降温至30℃诱导表达重组蛛丝蛋白。诱导初期细菌的生长活性还保持较高,菌体密度继续增加,最大菌体密度达到OD600 57.15,但比生长速率降至0.02。诱导后发酵液中的营养成分,除了供给细菌生长所需外,还要供给外源基因的表达,所以补料速度要提高,一般控制流速在100ml/h。诱导6h后,最终蛛丝蛋白的表达量可以达到20.8%。
