猪的流感(SI)主要是H1N1和HSN2亚型猪流感病毒(SIV)引起的，而对于SI疫苗的研究也主要集中在这2种亚型。HINl和HSN2灭活疫苗先后得到应用，并在预防猪流感的发生和蔓延中发挥了重要作用。此外，亚单位疫苗和核酸疫苗也得到了广泛的研究。因为灭活疫苗本身存在有许多缺点，而研究发现类型不同的疫苗在预防流感时有相互补充的免疫加强作用。所以通过研究各种疫苗的优缺点，取长补短，可实现免疫效果的最佳化。
1常规疫苗(灭活疫苗)
1918～1919年间2000多万人死于发生在20世纪最大的流感大流行以后，A型流感病毒被认为是导致人类疾病和死亡的主要原因之一。虽然特异有效的抗病毒药物可抑制本病的发生，但是疫苗免疫始终被认为是预防流感的最佳措施。在所有的预防流感的疫苗中，灭活疫苗是全世界广泛接受的疫苗。灭活疫苗被公认可降低畜群对流感的敏感性和攻毒后机体散播病毒的能力，也可使流感流行的范围缩小，使疾病引起的损失降到最低(Allwinn等，2002)。而自从1930年分离到第一株流感病毒以后，就具备了制作灭活疫苗的条件，事实上随后的几十年中临床应用的灭活疫苗得到显著的改善。当前使用的灭活疫苗因为包含了与变异频繁的流行株相匹配的抗原，其可靠性和有效性更为确定。灭活疫苗通过诱导机体产生抗血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)等的抗体，从而产生对感染的保护。Ruben等(1987)报道灭活疫苗可以使发病率减少30％～70％，使死亡率减少60％～87％。虽然接种部位的副作用明显，但是并不严重。比如发热，有时发生，但不会持续48 h以上。每年的秋季应该接种灭活疫苗，但是在流感爆发时或爆发中，不能接种。此外，灭活疫苗对攻毒的保护情况与免疫后机体产生的抗体水平紧密相关，除了疫苗本身以外，佐剂和抗原接种剂量都是疫苗有效性的影响因素(Van等，2001)。Lim等(2001)用福尔马林或乙醚灭活全病毒后经鼻腔内接种免疫猪，结果在免疫猪的鼻腔分泌液和血清中均检测到了病毒特异的IgG、IgM和IgA；攻毒后，没有出现明显的抗体反应，显示病毒的复制受到抑制，免疫猪获得保护。这证实了灭活疫苗在猪流感的防制中是有效的，也为评价灭活疫苗鼻腔接种对人的免疫保护提供了借鉴。Haesebrouck等(1986)研究证实猪H1N1病毒灭活疫苗免疫1次只能对攻毒产生部分保护力，表现为温和的临床症状和病毒复制的抑制，并且受保护的水平和机体所产生的HI抗体滴度有关；但是间隔一定时间后进行二免，则可提供抵抗攻毒的完全保护，攻毒后抗体水平不会升高且不能在呼吸道分离到病毒。
在应用灭活疫苗预防流感的时候，可能因为病毒成分的改变影响病毒的免疫原性。Haneberg等(2001)研究发现，在流感灭活疫苗中混入霍乱毒素或一种细菌微粒可以有效促进黏膜对病毒的吸收，进而促进黏膜下的淋巴组织介导的免疫反应，提高疫苗对机体的保护力。临床应用证明全病毒灭活疫苗不仅具有良好的免疫保护作用，而且安全性好，不会出现毒力返强，便于储存和运输，并且可以方便的制成针对几种不同亚型病毒的多价疫苗。
虽然灭活疫苗的免疫效果显著，但也存在着缺点：①对于免疫耐受性动物以及幼年或老年动物免疫效果不佳；②会受到母源抗体的影响导致免疫失败；③伴有一些副作用诸如疼痛、肌痛等；④偶尔会出现对鸡胚蛋白的过敏反应；⑤灭活疫苗的接种会对疫苗免疫猪和自然感染猪的鉴别诊断造成障碍，影响疫病的监测。更为危险的是病毒在鸡胚体内的传代本身就容易引发变异，导致免疫效力的下降。
2亚单位疫苗
亚单位疫苗是提取或合成SIV免疫相关蛋白，辅以佐剂制备而成。研究结果表明此种疫苗具有很好的安全性，而且因为只是病毒的特定蛋白在起作用，所以对于诊断、免疫剂量等都可以达到人为控制的目的。灭活疫苗在预防猪流感时存在许多缺点，而研究发现亚单位疫苗可以在多方面起到补充作用。在常规疫苗中HA和NA同时存在于病毒粒子表面，抗原间存在竞争性抑制关系，HA对NA产生的 T细胞和B细胞免疫有一定抑制作用，但是将HA和NA纯化后作为亚单位疫苗或作为常规疫苗的补充物可消除这种竞争关系(Johansson等，1996)。Jo— hansson等(1999)利用在杆状病毒表达系统中表达的HA／NA，纯化后混合或单独作为亚单位疫苗免疫小鼠，结果无论混合或是单独接种均能刺激产生高水平的抗体反应，而且所产生的抗NA抗体明显要高于传统的灭活单价疫苗；而对于同种亚型或亲缘关系较近的异型病毒的攻击可产生抑制病毒感染的作用，对于亲缘关系较远的不同亚型病毒的攻击也产生了明显的优于常规灭活疫苗的保护。Johans— son(1994)也证实了经纯化的N1一NA和N2一NA联合免疫可起到交叉保护作用，并且消除了常规疫苗中HA／NA的竞争性免疫抑制关系，为免疫耐受群体的流感免疫提供了一种新途径。
传统疫苗只能产生针对其来源病毒的免疫反应，而不能抵抗异型病毒的攻击。由于各亚型病毒的 HA或NA在刺激机体产生针对同型病毒的保护力上是有效的，所以Johansson等(2002)将提纯的Nl— NA和N2一NA作为流感疫苗的补充物制成三价疫苗，在鼠体试验可产生和传统疫苗同样水平的HA抗体，以及和NA混合物同样水平的NA抗体，并且可抑制H1N1和HSN2各种同型或异型病毒的增殖。Bacon等(2000)对比发现仅以病毒(Panama株)表面蛋白(PSAs)HA和NA鼻腔免疫小鼠，只能产生微弱的免疫反应，而用水凝胶作为佐剂将大大促进机体的体液免疫水平，对呼吸道IgA反应的影响不大，用壳聚糖作为免疫佐剂则可刺激产生强烈的局部和全身抗病毒免疫反应，即非常高的IgG和IgA水平。生物黏合剂也能有效促进鼻腔分泌液中的 IgA反应。特别值得一提的是对猪的流感免疫，生物黏合剂微球体疫苗鼻腔内接种获得的免疫效果比同等剂量肌肉注射的免疫效果更优。
此外，合成针对NP细胞毒性T淋巴细胞反应表位的多肽(366～374)与抗CD40单克隆抗体混合，经脂质体包装后鼻腔接种小鼠。结果可有效刺激产生保护性抗病毒CTL反应，而且可引发黏膜免疫反应，进而减少病毒在肺内的复制，这也说明抗 CD40单克隆抗体可做为一种刺激产生黏膜免疫反应的佐剂。Jeon等(2002)在一种质粒中串联表达了刺激B细胞的HA表位(HA91～108)、刺激辅助性T细胞的NP表位(NP55～69)和刺激细胞毒性T细胞的NP表位(NPl47～158)，将此翻译肽段免疫小鼠后产生了体液免疫和辅助性T细胞反应，小鼠可抵抗致死性病毒的攻击，并迅速得以康复。这证明在合成多肽免疫的应用中，可考虑将刺激免疫系统的不同位置的抗原表位串联表达，以期达到最佳的免疫效果。
3基因免疫
虽然亚单位疫苗可作为灭活疫苗的有效补充，但是保护力较弱，原因是蛋白的体外表达或纯化可能引起其天然构象的改变。流感病毒因为感染谱广、免疫相关蛋白清晰而被广泛应用于对鼠和其它动物基因免疫的模型研究中。因为自然产生的抗病毒能力是由抗体介导的，这对于已经发生抗原漂移和变异的病毒株将不产生保护，所以产生对于保守蛋白的细胞免疫反应是防疫的关键。基因免疫不仅可刺激机体产生体液免疫反应，而且可产生细胞免疫反应，所以在研制流感疫苗的过程中有着潜在的开发前景。Operschall等(2000)构建表达HA基因的 DNA疫苗，一次免疫小鼠，仅有少数小鼠产生抵抗同源病毒的致死性攻击的保护力，加强免疫可使保护率加倍，而与表达GM—CSF或IL一2的质粒共同免疫则100％的小鼠获得保护。Larsen等(2001)发现：单纯接种HA DNA疫苗只能刺激机体产生低水平的病毒特异性抗体，对攻毒保护性也很差，但是在 HA DNA免疫后4周用灭活疫苗进行加强免疫，机体产生高水平的病毒特异性血清抗体，并且对攻毒的保护明显要优于单纯用HA DNA疫苗进行2次免疫。此外，DNA免疫的剂量、接种途径以及免疫刺激因子的共投递等都会影响SIV的基因免疫效果。增加免疫剂量可增强病毒的体液免疫反应，而舌内腹侧的接种效果明显好于腹部皮内的接种。单纯的 HA DNA疫苗或与IL一6共投递均不能在鼻腔分泌物中检测到抗体，也不能产生对攻毒的足够保护，但是可检测到特异的高水平体液免疫反应。Chen等(1998，2000)构建不同亚型病毒的NA DNA疫苗，免疫小鼠后用同种亚型和不同亚型的病毒进行致死性攻击，结果表达H3N2 NA的DNA疫苗可抵抗同种亚型的各种抗原变异株的攻击，但不能提供对不同亚型HINl的攻击保护。这说明NA DNA疫苗有望成为流感免疫的一个新的补充。有报道指出流感的不同亚型间的交叉保护(HIS)是交叉反应性抗体介导的，但Mitchell等(2003)研究发现虽然在鼠体内并没有检测到抵抗异源病毒的中和性抗体存在，但融合表达HA与鼠补体C3d部分的DNA疫苗可刺激鼠体产生针对各种亚型流感病毒的致死性攻击，这说明HA的DNA免疫同样可刺激机体产生细胞毒性T淋巴细胞反应。
回顾流感病毒DNA疫苗的鼠体试验，可总结如下：①表达HA／NA的DNA疫苗免疫效果明显好于编码其它病毒蛋白的DNA疫苗；②共表达或共投递 HA和NA的DNA疫苗产生的保护要优于一种蛋白的作用；③NA DNA疫苗不仅可提供同源病毒攻击的保护，而且可刺激机体产生对发生抗原漂移病毒的交叉保护；④HA的DNA免疫可产生和灭活疫苗同样的免疫效果，即不能抑制病毒的初始感染，但随后的病毒增殖得到了抑制，从而在感染早期病毒得以清除(Macklin等，1998；Ze等，2000)。同时 DNA疫苗与其它疫苗相比有如下优点：①安全可靠，不会产生非编码蛋白以外的其它成分；②抗原合成和递呈过程与病原的自然感染相似，内源性合成的抗原蛋白直接转运到细胞表面，通过MHC—I和 MHC一Ⅱ类分子直接递呈给免疫系统；③易于构建和制备，稳定性好，成本低廉，便于储存运输和注射。
4病毒活载体疫苗
活载体疫苗克服了灭活疫苗和亚单位疫苗的不足，同时具有弱毒疫苗的一切优点。其利用的是体内表达系统，所表达的蛋白更加真实，而且因为病毒自身的复制能力，所以只需极少剂量的接种就可产生足够外源蛋白。重组活载体疫苗可同时启动体液免疫反应和细胞免疫反应，不会出现毒力返强，而且产生的保护性反应是针对载体病毒和外源蛋白来源病毒的，所以可达到一针防多病的目的。表达人流感病毒的HINl、H3N2亚型HA的重组痘苗病毒能够诱导血凝素的产生，并刺激机体产生免疫反应。
Kretzschmar等(1997)在水泡性口炎病毒(VSV)G基因上下游分别插入流感病毒的HA和
NA基因，获得表达HA／NA蛋白的重组VSV，结果表达的HA／NA不仅被运输到细胞表面，而且经血细胞吸附、溶血性和神经氨酸酶鉴定等试验证实表达蛋白具有生物学活性，生化试验也证实大量的 HA和NA组装进入了VSV病毒颗粒中，免疫电镜观察可见到在重组病毒形成的粒子中包含有大量的 VSV G与流感病毒HA和NA的嵌合体。Tang等(2002)构建了表达H3N2猪流感病毒HA基因的重组非复制型腺病rAD—HA，用流式细胞技术对体外感染细胞检测，证实表达的HA与流感病毒自身感染合成的HA相似，并被转运到了细胞的表面。用此病毒免疫小鼠后，在第14 d可检测到所产生的针对 SIV的中和抗体。更进一步，在一免后35 d进行二免，中和抗体滴度有显著的增加。用异源病毒A／ HK／1／68(HN)流感病毒进行致死性攻击，结果发现重组病毒免疫组产生了对攻毒的部分保护能力。虽然攻毒后病毒仍可在鼠体内复制并引起轻微的临床症状，但是很快得到了康复，并且不会影响到小鼠的增重。蚀斑减数试验发现rAD-HA对于攻毒株不能诱导产生交叉反应抗体，说明在免疫保护过程中细胞介导的免疫反应发挥了重要作用。
总之，利用重组活载体疫苗免疫预防猪流感不仅可诱导产生高水平的中和抗体和HI抗体，而且可产生细胞免疫反应，从而起到抵抗同种亚型的异源病毒攻击的保护效果。此外，在猪重组活载体疫苗研究中，被广泛应用的伪狂犬病(PRV)病毒载体具有插入点多，可容纳片段大等优点。相信在PRV基因组中插入SIV的HA、NA、NP或联合插入多个基因，会获得更好的免疫效果，并且在实践应用中同时可起到抵抗2种引起呼吸道和生殖道疾病的病原。
中国畜牧兽医 2005年第32卷第5期
姜建宏，刘皙洁，张雷(东北农业大学动物医学院，哈尔滨 150030)
