植物细胞培养生产重组蛋白

植物细胞培养生产重组蛋白
　　植物细胞培养的历史起源于20世纪初,30年代迅速发展,它包括植物器官、组织、细胞、原生质体、胚以及植株的培养。植物细胞培养的应用主要有以下三个方面,即用于有用物质的生产、快速繁殖以及植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的研究。而植物细胞培养技术应用于重组蛋白的研究却是在最近20多年来才发展起来的。自从1990年[1]第一个重组蛋白在植物细胞培养合成以来,已有20多种重组蛋白在植物细胞培养中得以生产,它们包括抗体、酶、激素、生长因子和细胞分裂素[2]。
1　植物细胞培养的优势
植物细胞培养作为重组蛋白的生产系统,集合了微生物发酵、动物细胞培养和完整植株培养系统的很多优点[3]。植物悬浮细胞既能像微生物一样能在简单的培养基中较快地生长,培养基不需要做特殊处理,不需要太昂贵的生产设备;也能像动物细胞培养一样合成较复杂的多聚体蛋白和糖蛋白,如免疫球蛋白和白细胞介素,而且不携带人类病原菌,不产生内毒素;它还能像完整植物培养系统一样进行转入后的修饰、翻译后的糖基化。Ｇｏｍｏｒｄ等人[4]在2004年报道:用植物细胞培养合成的重组人体糖蛋白相对于用酵母、细菌和丝状真菌合成的重组人体糖蛋白具有同天然人体糖蛋白更大的相似性。与田间完整植株培养不一样,植物细胞培养生产重组蛋白不受气候、土壤质量、季节、除草剂和杀虫剂等因素的影响。更重要的是它具有较简单易行的产物分离纯化过程,特别是当目的重组蛋白能分泌于悬浮细胞培养液中时。所有的这些优势是整个生产过程的ＧＭＰ标准化的前提条件。
2　生产原则
2.1　宿主细胞的选择
植物细胞培养的方法主要包括发根、茎瘤状物、固定细胞和悬浮细胞的培养,其中悬浮细胞较容易地用生物反应器来进行ＧＭＰ生产。悬浮细胞的选择,也就是宿主细胞的取材主要来自于拟南芥[5]、紫杉[6]、烟草、紫花苜蓿、水稻、番茄和大豆等。烟草细胞株ＢＹ 2和ＮＴ 1是应用最为广泛,因为它们的细胞易于转化和繁殖,有较好的生长特性。但是近来的研究[7～10]表明:水稻、番茄和大豆细胞株是比烟草细胞株更为合适的宿主细胞,因为水稻、番茄和大豆本身可以食用,可调控性好,表达水平较高,能有效地分泌蛋白,而且蛋白含量较高。植物悬浮细胞可由摇瓶培养愈伤组织或发酵形成单细胞和细胞聚集体而得到。愈伤组织不同于在土壤种植中的培养株,因为培养株包含有不同状态的细胞和组织结构,而愈伤组织只具有一种未分化的单一细胞。如果用转基因植物作为悬浮细胞培养的材料,那么就没必要再对培养的悬浮细胞进行基因调控。如果用的是非转基因植物作为愈伤组织的材料,那么就得把重组的质粒转入到植物细胞中,再对植物细胞进行筛选确定重组好的细胞株,最后进行悬浮细胞的培养。
2.2　重组蛋白的构建
除了宿主细胞的选择外,重组蛋白的构建也相当重要,它是决定重组蛋白产量的重要因素。构建的原则主要有以下两点:
一是启动子的有效选择,它通过决定转录水平的高低来影响重组蛋白的产量。用得较多的组成型启动子是花椰菜花叶病毒(ＣａＭＶ)35ｓ的启动子及其高级启动子和(ｏｃｓ)3ｍａｓ混合启动子;用得较多的诱导型启动子是α 淀粉酶Ｒａｍｙ3Ｄ的启动子。
二是前导肽的构建,前导肽的有无或构建的好坏直接影响到重组蛋白的分泌途径。植物和非植物的前导肽都可适用,有些人体分泌蛋白用它们的内源前导肽已经在植物细胞中获得表达[10]。分子量不到30ｋＤａ的蛋白质一般分泌在植物悬浮细胞培养液中,而更大分子量的蛋白质则留在细胞内。另外,蛋白质的电荷性和亲水性也是决定蛋白质是否分泌于植物细胞培养液中的重要因素,如分子量较大的抗体也是分泌在植物悬浮细胞培养液中的。
2.3　植物悬浮细胞培养速率和摄氧速率
植物悬浮细胞的生长速率为0.019/ｈ～0.028/ｈ,微生物细胞培养的生长速率为0.1/ｈ～1/ｈ,虽然它们的生长速率相差较大[11],生长曲线也不一样,但是植物悬浮细胞的培养原则仍也可参照微生物发酵的原则。Ｎａｇａｔａ等人[12]在1992年报道,烟草细胞株ＢＹ 2的悬浮细胞培养生长速率为0.044/ｈ,并且尼古丁含量很低的。另外,植物细胞培养的摄氧速率也较低,为1～3.5ｍｍｏｌ/ｌ·ｈ,而细菌的摄氧速率为5～90ｍｍｏｌ/ｌ·ｈ,尽管它们的摄氧速率相差较大,但传统的发酵策略经过一定的修整仍可应用于植物悬浮细胞的培养并能获得预期的效果。
3　下游过程和重组蛋白产量的提升
3.1　重组蛋白的分离纯化
下游过程是每种生物制品生产过程不可或缺的组成部分,也是提高重组蛋白产率的主要部分,其主要过程是重组蛋白从培养液中或悬浮细胞中的分离与纯化过程。用在该过程的资金占整个生产过程资金的80%以上。尽管针对于每一种重组蛋白都需要一种特定的分离纯化过程,但仍有一些共同的分离纯化标准和步骤。如用于临床的重组蛋白需要的要求最高,它的整个分离纯化过程必须达到生物医药产物系统的标准,包括质量安全和质量控制等严格的规则。对于一般用处的重组蛋白,其分离纯化的可以用如下的方法处理。
如果重组蛋白是分泌蛋白,它的活性和稳定性一般在植物悬浮细胞生长的指数期达到最高,确定了植物细胞的生长曲线就可很容易获取分离的最佳时机。分离后的下一步就是运用层析技术纯化所需要的目的蛋白。该过程的粗产物体积较大,如果能尽可能地浓缩和选择有效的吸附材料,那么用层析技术来纯化目的蛋白的前景就会更大。
如果重组蛋白是胞内蛋白,它们的分离过程与从转基因植物中分离目的蛋白的过程很相似。先是通过过滤得到悬浮细胞,并进行细胞壁、细胞膜的破碎。其主要的方法有湿样研磨、超声波处理和高压均质化和酶处理法。因为植物悬浮细胞是生长一致的单细胞,比起植物组织,悬浮细胞的破碎更会有效。接着是抽提,尽管这一步要除去一些细胞碎片,但它的优势在于起始材料的体积很小,目的蛋白的浓度较大。第三步是应用层析技术对目的蛋白进行更进一步的纯化。
3.2　重组蛋白产量的提升
用植物细胞培养生产重组蛋白,其产率的范围变化很大,表示方法也不很一致。用重组蛋白占培养液中可溶性蛋白的比率表示,其范围在0.0064%～4%之间;用单位体积培养液中含重组蛋白的质量表示,其范围在0.5μｇ/Ｌ～200ｍｇ/Ｌ之间[12]。在很多情况下,重组蛋白的产量与重组蛋白是否分泌于植物细胞培养液或是否很容易分离纯化密切相关。植物细胞培养液中的杂蛋白较少,便于重组蛋白的分离;而且培养的植物细胞从培养液的分离过程比微生物从其发酵液中分离的过程简单得多了,一般只需要通过直接的过滤即可得到。2001年,Ｈｕａｎｇ等人[10]用α 淀粉酶Ｒａｍｙ3Ｄ的可诱导型启动子在水稻细胞内表达重组蛋白α 1抗胰蛋白,重组蛋白含量达到了200ｍｇ/Ｌ;2002年,Ｓｍｉｔｈ等人[13]用(ｏｃｓ)3ｍａｓ启动子在大豆细胞内表达ＨｂｓＡｇ,重组蛋白的含量达到了22ｍｇ/Ｌ;2003年,Ｋｗａｎ等人[14]用高级ＣａＭＶ35ｓ启动子在烟草细胞内表达ＩＬ 12,重组蛋白的含量达到了了800μｇ/Ｌ。2004年,Ｙａｎｏ等人[15]用ＣａＭＶ35ｓ的启动子在烟草细胞株ＢＹ 2内表达ＨｂｓＡｇ的单克隆抗体,其重组蛋白的含量达到了15ｍｇ/Ｌ。重组蛋白产量的提高还可以通过优化培养条件或培养液的组成来实现。应用于微生物发酵的主要策略都可应用植物细胞培养,如间歇发酵、补料分批培养、罐流培养等。随着基因工程和蛋白质下游技术的迅速发展和研究的不断深入,重组蛋白的产量将会逐步得到提升。
4　有待解决的问题
4.1　重组蛋白在生产中的稳定性
重组蛋白在植物细胞培养生产过程中的稳定性是科研工作者面临的一个巨大挑战。虽然有很多宿主细胞用来作为表达重组蛋白已经有很多年的历史,但至今为止,还没有建立起宿主细胞株的特性库以达到ＧＭＰ生产的要求。细胞株特性库的建立是工业生产不可缺少的要素,因为它限定了生产的起始材料和生产过程的具体路线,并决定了重组蛋白是否能达到稳定性和一致性。另外,重组蛋白在悬浮培养液中很容易分解。2002年,Ｄｏｒａｎ等人[16]报道,纯化的重组鼠蛋白ＩｇＧ1加入到无菌的ＭＳ培养基中,在2ｈ内该蛋白有80%分解掉了。主要的原因是重组蛋白被水解、聚集和一些未知的因素。
4.2　外源基因的逃逸
稳定整合在植物基因组中的外源ＤＮＡ将与植物基因组ＤＮＡ一起参与几乎所有的遗传学行为,因此,这些外源ＤＮＡ不仅仅存在于该转基因植物的后代,也有可能随该植物细胞培养过程中向环境中漂移或者引起基因的沉默[17]。外源基因漂移或沉默后,目的重组蛋白的产量就下降了。
5　结束语
随着基因工程和蛋白质下游技术的迅速发展,用植物细胞培养来进行重组蛋白的商业化生产是很多科研工作者近年来研究的热点。但如何建立起宿主细胞的特性库以达到ＧＭＰ生产材料的要求;如何更快速有效地分离纯化目的重组蛋白;如何解决植物细胞培养过程中由基因漂移或者基因沉默带来产物的不稳定性等问题,仍是我们面临的挑战。这些问题的顺利解决,将会加快用植物细胞培养生产重组蛋白的商业化进程。