耐高温a-淀粉酶是食品工业中应用最普遍的酶种之一,广泛应用于啤酒、酒精、味精及淀粉工业等领域[1]。其适用pH范围为6~7,在酸性条件下其酶活明显降低,不能满足酸性条件下淀粉原料深加工工艺的要求,因此对耐酸性a-淀粉酶的需求日益上升。20世纪90年代以来国外已陆续有耐酸性a-淀粉酶的研究报道[2,3]。而我国的a-淀粉酶品种较单一,目前还未见相关报道。
枯草芽孢杆菌由于其安全性和分泌胞外蛋白的特点,被认为是表达和分泌异源蛋白的理想受体[4]。但外源基因在枯草芽孢杆菌中的表达水平一般比大肠杆菌低,原因之一是由于枯草芽孢杆菌可向胞外分泌高浓度的蛋白酶,以致影响了表达产物的稳定性。而DB403是三蛋白酶缺陷菌株,有助于提高分泌蛋白的稳定性。另外某些外源基因的表达产物对宿主存在一定的毒害作用。构建诱导型分泌表达系统可将宿主菌的生长与外源蛋白的表达两个过程分开,是克服这个问题的重要途径之一。芽孢杆菌的sacB基因编码果聚糖蔗糖酶,此胞外酶的表达受蔗糖诱导[5]。本研究中将地衣芽孢杆菌的耐高温a-淀粉酶基因进行耐酸性改造,利用获得的sacB基因的启动子-信号肽序列(称为sacR)构建诱导型分泌表达载体,并实现了在枯草芽孢杆菌中的分泌表达。为耐酸性a-淀粉酶的工业化生产奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 菌株和质粒
E.coli菌株BL21(De3),JM109,Bacillussub2tilisDB403(HisnprR2,npre18aprA)由本实验室保存;质粒peT-22b,购自NOVAGeN公司(含T7启动子的高效表达载体);大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒pBe2,由天津大学赵学明教授惠赠;质粒pSA60含有枯草芽孢杆菌sacB基因的启动子信号肽序列,由中山大学罗进贤教授惠赠;质粒peTAM含有地衣芽孢杆菌耐高温a-淀粉酶基因,由本实验室构建。peTAM是由peT-22b的上游和下游分别被NdeI和HindIII酶切后与经同样双酶切的a-淀粉酶基因连接构建而成。
1.2 工具酶和试剂
限制性内切酶NdeI、HindIII、XbaI、BamHI、PstI,T4DNA连接酶、TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司;核酸分子量标准、氨苄青霉素、卡那霉素均购自上海生物工程公司;所用试剂盒购自Promega公司,引物合成及测序由TaKaRa公司完成。
1.3 培养基
LB液体培养基用于细菌培养。筛选培养基是分别含氨苄青霉素50Lg/mL和卡那霉素100Lg/mL的LB/琼脂培养基。酶活初步检测培养基是含1%淀粉的LB/琼脂培养基(pH4.5),用作透明圈选择;枯草芽孢杆菌转化培养基用GMI、GMII培养基[6]。
1.4 DNA的提取及操作
质粒的快速提取及检测以及DNA的酶切、连接、大肠杆菌感受态的制备及转化按文献[7]所述方法进行。枯草芽孢杆菌转化参照[6]的方法。
1.5 阳性转化子的筛选
将适当体积已转化的感受态细胞涂布在含氨苄青霉素的筛选培养基上,37℃倒置培养16~20h,挑选单菌落接种于酶活检测培养基上。接种于酶活检测培养基上的转化子,37℃培养3d后,将酶活检测平板置于50℃保持3h,再用碘液熏蒸,在菌落周围形成透明圈者即为阳性转化子。
1.6 重组蛋白的诱导表达及检测
将重组枯草杆菌接种于LB培养基中,37℃过夜培养,次日按5%接种量转种至新鲜的LB培养基,37℃快摇2h加入终浓度为2%的蔗糖溶液进行诱导。
1.7 酶活力的测定
参照日本专利[8]中所使用的测定酸性a-淀粉酶活性的方法。取10mL1%淀粉溶液(pH4.0)放入一支试管内,于40℃预热10min后,加入1mL的发酵液,摇匀,精确保温10min。用移液管吸取1mL置于盛有10mL 0.1mol/LHCl的试管中,再取0.5mL混合液体于盛有10mL碘液的试管中,摇匀,并立即用分光光度计于660nm处测定吸光度。用同样方法测定空白值,但不加发酵液,而带之以1.0mL的蒸馏水。以蒸馏水作为参比液。酶活定义:1个酸性a-淀粉酶单位相当于在pH4.0,温度40℃,1min将浓度为1%的马铃薯淀粉溶液的显蓝强度降低1%时所需酶量。酶活=(D0-D)x100/D0x10x稀释倍数D0为空白值吸光度,D为主值吸光度,100为系数(%),10为反应时间(min)。
1.8 粗酶液的制备
采用盐析-透析方法进行粗酶的提取。盐析法:将发酵液4000r/min离心除去菌体,取上清液用硫酸铵分级盐析,取40%~60%分级盐析得到的蛋白沉淀,溶解于去离子水中,用透析袋透析48h,所得的酶液用于粗酶的酶学特性的研究。
1.9 酶反应最适pH
配置不同pH范围的1%马铃薯淀粉底物溶液,pH为3~7。取10mL淀粉溶液放入1支试管内,于40℃预热10min后,加入1mL的酶液,摇匀,精确保温10min。用移液管吸取1mL置于盛有10mL0.1mol/LHCl的试管中,再取0.5mL混合液体于盛有10mL碘液的试管中,摇匀,并立即用分光光度计于660nm处测定吸光度。用同样方法测定空白值,但不加粗酶液,而带之以1.0mL的蒸馏水。以蒸馏水作为参比液。测定酶活后,计算相对酶活,pH-相对酶活作图,得到酶反应的最适pH值。
2 结 果
2.1 耐高温a-淀粉酶基因的定点突变
根据序列分析结果和文献[2],将134位的L-亮氨酸变为L-精氨酸,320位的L-丝氨酸变为L-丙酸后,将对耐高温a-淀粉酶的pH耐受性产生影响反应到核苷酸序列上就是将编码L-亮氨酸的密码CTA改为编码L-精氨酸的密码子CGC,将编码L-丝氨酸的密码子TCG改为编码L-丙氨酸的密码GCG。基于此拟用重叠PCR技术进行定点突变[9]
设计引物如下:
上游引物F1:5'2AACATATGAAACAACAAAAACGGCTTTACG23'NdeI
下游引物R2:5'2AAAAGCTTCCTGAGGGCTGATGATGACACTTTG23'HindIII
重叠引物A:5'2GAGAACACCGCATTAAAGCCTGGAC23'
重叠引物B:5'2GTCCAGGCTTTAATGCGGTGTTCTC23'
重叠引物C:5'2AAGCATCCGTTGAAAGCGGTTACAT23'
重叠引物D:5'2ATGTAACCGCTTTCAACGGATGCTT23'
在上游引物和下游引物5'端分别引入NdeI HindIII酶切位点。重叠引物A与重叠引物B互补重叠引物C与重叠引物D互补。重叠引物A与B包含了对134位氨基酸的突变,即重叠引物A中下划线的3个核苷酸残基就是编码L-精氨酸的密子。而重叠引物C与D中则包含了对320位氨基的突变,同样重叠引物C中有下划线的核苷酸残就是编码L-丙氨酸的密码子。
以peTAM质粒上的a-淀粉酶基因作为模板,如图1所示进行PCR,获得第134位氨基酸和第320位氨基酸突变的a-淀粉酶基因。扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳检测大小为1.7kb,与目的片断相同。将扩增产物用NdeI和HindIII双酶切,并连接到同样双酶切的载体peT-22b上,构建重组质粒peTAT,转化大肠杆菌BL21(De3)。在含有氨苄青霉素的LB/琼脂平板上挑取转化子。将阳性转化子逐一点接在pH4.5的LB/琼脂淀粉平板上,培养3d后用碘液熏蒸,以BL21(De3)/peTA为对照。挑出透明圈直径最大的转化子(图2),经酶切验证证实突变的a-淀粉酶基因已成功转入大肠杆菌BL21(De3)。经测序与预期结果完全相同。由此说明通过重叠PCR技术,已成功的将a-淀粉酶134位的编码L-亮氨酸的密码子CTA改为编码L-精氨酸的密码子CGC,320位的编码L-丝氨酸的密码子TCG改为编码L-丙氨酸的密码子GCG,位点完全正确。且这2个位点的改变使其耐酸性明显提高。
2.2 诱导型分泌载体pBSAT的构建
用XbaI和HindIII双酶切质粒peTAT,琼脂糖凝胶电泳回收并纯化1.7kb的小片断,得到包含起始密码子ATG的完整的突变a-淀粉酶基因。与同样酶切处理的pBE2连接,构建重组质粒pBEAT,并转化大肠杆菌JM109。在含有氨苄青霉素的LB/琼脂平板上挑取阳性转化子,进行酶切验证,琼脂糖凝胶电泳显示重组子双酶切后有2条带,大小分别为117kb(突变a-淀粉酶基因)和6.2kb(载体pBE2.0),见图3。
大量提取质粒pSA60,用BamHI和PstI进行双酶切,胶回收约550bp大小的片断,与经同样双酶切的重组质粒pBEAT进行连接,构建重组分泌载体pBSAT(见图4),转化大肠杆菌JM109。从含氨苄青霉素的LB/琼脂抗性平板上筛选阳性转化子,经酶切验证证实,sacR已插入重组载体中的a-淀粉酶基因的上游,见图5。测序结果表明,重组分泌载体中插入的sacB基因的启动子2信号肽序列与发表的sacB基因5'端从17~551位碱基的序列完全相同。它包括sacB基因的启动子、200bp的类似转录终止信号的序列、核糖体结合位点及编码29个氨基酸的信号序列。且sacB信号肽序列与地衣芽孢杆菌a-淀粉酶基因的编码序列之间的读码框架是正确的。
2.3 a-淀粉酶基因在枯草芽孢杆菌中的诱导表达
将构建的重组质粒pBSAT转化枯草杆菌DB403的感受态细胞,在含有卡那霉素LB/琼脂平板上筛选阳性转化子。经酶切验证证实,阳性转化子所含质粒是pBSAT。将枯草芽孢杆菌DB403/pBSAT接种至LB培养基中,37℃过夜培养。次日按5%接种量转接于新鲜的LB培养基中,培养2h后加入蔗糖溶液至终浓度为2%,诱导24~48h。定时取发酵液离心,取上清液测定酶活,并以不加蔗糖诱导作为对照。结果如图6。重组菌株DB403/pBSAT接种后8h,a-淀粉酶基因开始被诱导表达,28h达到最高值。再继续延长诱导时间,则a-淀粉酶活力下降。这可能是枯草杆菌中的蛋白酶基因开始大量表达,从而对外源基因表达产物发生了降解的缘故。同时可以看出在蔗糖诱导28h后,a-淀粉酶的表达量是不诱导的10倍以上,说明a-淀粉酶基因的表达是受蔗糖诱导的。且在sacB信号序列的引导下成功的分泌到细胞外,完成了分泌表达。
2.4 粗酶反应的最适pH
测定突变a-淀粉酶粗酶液最适pH,结果如图7。该酶在pH3.0时几乎完全失活,在pH4.0时相对酶活为66%,其最适pH为5.0。
3 讨 论
本项研究中,选择蛋白酶三缺陷型突变株DB403作为受体菌,并利用诱导启动子系统使细胞的生长和基因的表达两个过程分开。使用诱导启动子系统既可减少外源基因对宿主生长的影响,又有利于外源基因在宿主菌中的稳定存在。蔗糖诱导是在枯草芽孢杆菌中常用的诱导体系,此系统中的可诱导基因是编码果聚糖蔗糖酶的sacB基因。该基因既具有蔗糖诱导表达所需要的诱导区域,也具有使蛋白有效分泌的信号肽序列,而且有很多可以促进其表达的调控子系统,如degU,prtR,degQ等,可以使sacB基因的表达增加10~100倍[10]。
本研究将a-淀粉酶基因进行耐酸性改造后,以sacB基因的启动子和信号肽序列为基础,构建了诱导型表达载体,引入蛋白酶三缺陷型突变株DB403。实现了a-淀粉酶基因的分泌表达,且经过改造的a-淀粉酶基因的表达产物具有较强的耐酸性。
