氨肽酶是一类从多肽链Ｎ末端顺序逐个水解氨基酸的酶。在食品工业上通常与蛋白酶复合使用,广泛应用于调味品和干酪的生产、蛋白水解液的脱苦、蛋白质深度水解和多肽的制备等方面[1]。随着食品工业的发展,氨肽酶的应用呈现出愈来愈广阔的前景。在国外,已能通过曲霉和乳酸菌发酵生产氨肽酶,并且实现了商品化[2];在我国,目前仅有少数复合风味蛋白酶的报道,并且其中氨肽酶活力低,而以氨肽酶作为单一目的酶的研究尚未见其他报道。
1 材料与方法
1.1 菌种
米曲霉(Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ)ＷＪ-05-1,本实验室保藏。以米曲霉ＷＪ-05-1作为产生氨肽酶的出发菌基于两方面考虑,一是,从食品安全性考虑,该菌种在食品发酵工业上的应用已经有相当长的时间;二是,该菌种有一定的氨肽酶活力,而且Ｎｏｖｏ和Ｇｅｎｅｎｃｏｒ等公司都以米曲霉作为氨肽酶生产菌[3]。
1.2 培养
1.2.1 培养基分离培养基(ｇ/Ｌ):蔗糖30,ＬＮＡ0.5,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.5,ＫＨ2ＰＯ4 10.0,琼脂粉1.7,ｐＨ6.4。
斜面培养基(ｇ/Ｌ):麦汁培养基,5～6°Ｂ啨麦汁,琼脂粉1.7,ｐＨ6.0。
种子培养基: 麸皮∶水=1∶1。
发酵培养基(ｇ/Ｌ):玉米浆30,麸皮60,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.5,ＫＨ2ＰＯ4 10.0,ＣａＣｌ2 1.0,ｐＨ6.8。
1.2.2 培养条件
种子和平板培养:在(31±0.5)℃恒温箱中培养
发酵培养:(31±1)℃,220ｒ/ｍｉｎ摇床振荡培养64ｈ。
1.3 菌种诱变
1.3.1 孢子的制备取培养成熟的麸皮种子,制备成单孢子菌悬液。吸0.1ｍＬ菌液于平皿中,涂布均匀,在超净台中晾干[4]。
1.3.2 Ｎ+注入处理在中科院等离子体所离子注入机上进行。将含菌的平皿放入真空室中进行离子注入,以10ｋｅｖ能量,2.6×1013ｉｏｎ/(ｃｍ2·ｓ)剂量率,分别按0ｓ(对照)、10ｓ、20ｓ、40ｓ、60ｓ、80ｓ不同时间作注入处理[5],靶室真空度为10-3Ｐａ。取出平皿,以5ｍＬ无菌水洗脱,稀释涂布分离平皿,于(31±1)℃培养72ｈ。
1.3.3 高产菌株的筛选
从分离平皿中挑选生长状态良好、水解圈相对较大的单菌落,分别接斜面培养基再培养,转接二代后接种子培养基,再接种于发酵摇瓶,经几轮发酵测定,逐步筛选高酶活菌株;高酶活菌株进一步分离,培养,再通过发酵测定,筛选目标高产菌[6]。
1.4 发酵条件的初步优化
在原有发酵培养基基础上,进一步优化碳源和氮源配方,确定最佳浓度、合适的碳氮比、初始ｐＨ条件;在此基础上,绘制该菌发酵产酶的过程曲线,确定最佳发酵时间,以及研究表面活性剂对产酶的影响。
1.5 酶活测定酶活定义:在40℃,ｐＨ8.0条件下,每分钟水解1μｇＬＮＡ所需的酶量定义为1个酶活单位。
测定方法:以ＬＮＡ(Ｌ ｌｅｕｃｉｎｅ 4 ｎｉｔｒｏａｎｉｌｉｄｅ)为底物进行测定。发酵滤液稀释若干倍后,取0 4ｍＬ加入6ｍＬｐＨ8.0的Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液中,40℃水浴预热5ｍｉｎ,加0 4ｍＬ26ｍｍｏｌ/ＬＬＮＡ 乙醇溶液(对照加蒸馏水),准确反应10ｍｉｎ,立即放冰浴中,5ｍｉｎ后于405ｎｍ处比色。
2 结果与讨论
2.1 诱变效果
2.1.1 不同Ｎ+注入剂量对菌株的诱变效果
在前述实验条件下,按(2.6～20.8)×1014ｉｏｎ/ｃｍ2不同剂量注入各组菌样,考察各剂量下的存活率、正变率、最高酶活等,结果如表1。规定酶活高于出发菌5%为正突变,正突变率=正突变菌株数/活菌数。
由表1可看出,随着Ｎ+注入剂量的增加,存活率降低,正突变率有增大趋势。当注入剂量达到15.6×1014ｉｏｎ/ｃｍ2以上时,存活率陡然降低,正变率显著提高。可见,当注入剂量达到15.6×1014ｉｏｎ/ｃｍ2以上时,对该菌株有比较好的诱变效果。不同注入剂量与存活率曲线如图1所示。
这与其他文献所报道的“马鞍型”曲线吻合,存活率随注入剂量增大,有一段不降反升的过程。出现这一现象,一种机制认为离子注入达到一定剂量,可以激活细胞的修复机制和修复酶,诱导Ｍｎ ＳＯＤ活性升高,使存活率回升[7];另一种机制认为,中高剂量下连续注入的离子堆积在细胞表面形成一个“保护屏障”,对细胞起保护作用,当电荷累计达临界值后产生库仑爆炸,使屏障作用消失[8]。
2.1.2 高产突变菌株的获得及遗传稳定性实验
由分离平板初筛挑选出水解圈相对较大的菌株84株,经过3轮发酵产酶能力测试,逐步筛选得4株产酶最高菌株Ｍ60-5、Ｍ60-10、Ｍ60-11、Ｍ80-10;再分别分离培养,进一步发酵筛选,得到2株高产菌株Ｍ60-5-13和Ｍ80-10-7,产酶能力均比出发菌株提高了30%以上。将Ｍ60-5-13和Ｍ80-10-7菌株连续传5代进行发酵产酶能力考察,每代实验过程:高产菌株单菌落→麸皮种子→摇瓶发酵→测定酶活,结果如表2。以均值作对照(100%),Ｍ60 5.13的相对酶活变化在93.8%～103.4%之间,Ｍ80-10-7的相对活力范围在96.5%～103.1%之间,显示2菌株都有较好的遗传稳定性。
2.2 发酵条件的初步优化
2.2.1 复合碳源的选择麸皮含多种维生素等生长因子,是一种重要的发酵原料,但麸皮中淀粉含量少,因此可以筛选出1种糖类与麸皮作为复合碳源。将麸皮淘洗数次,以除去淀粉,沥干。在发酵培养基基础上,改加6%的淘洗过的麸皮,分别按2%的量添加不同糖类,接种Ｍ80-10-7菌株(以下同)。摇瓶结果如表3。
结果显示,当以乳糖、麦芽糖和淀粉为碳源时,酶活水平较低;而以葡萄糖和果糖等单糖为碳源,酶活较高,因此果葡糖浆可以作为合适碳源。
2.2.2 果葡糖浆浓度的确定在发酵培养基基础上,分别按1%、2%、3%、4%、5%、6%不同含量添加果葡糖浆,摇瓶结果如表4,当果葡糖浆添加量为4%、5%时,产酶水平同为最高,继续加大添加量,酶活下降,因此确定果葡糖浆的添加量为4%。
2.2.3 氮源浓度的确定
玉米浆含多种氨基酸、维生素和嘌呤、嘧啶等生长因子,能提供菌体生长和酶合成的必需营养。在发酵培养基基础上,加4%果葡糖浆,玉米浆按1.0%、1.5%、2.0%、2 5%、3.0%、3.5%、4.0%分别配制培养基。摇瓶结果如表5。
结果表明,当碳氮比较高时,对产酶有利。当氮源加量为1.5%时,产酶水平最高,达到437.7ｕ/ｍＬ。而1.0%的加量则可能氮源供应不足,导致酶活有明显降低。可见氮源是影响发酵的重要因素。
2.2.4 初始ｐＨ条件的确定
起始ｐＨ值会直接影响菌体的生长,从而影响氨肽酶的产量。按果葡糖浆4%、玉米浆1.5%配制发酵培养基,考察发酵液起始ｐＨ从5.6变化到7.6对发酵的影响。结果如图2。
图2 起始ｐＨ对产酶的影响
如图2所示,在ｐＨ6.8处,酶活达到最高点,确定最佳起始ｐＨ为6.8。
2.2.5 Ｍ80-10-7菌株的产酶曲线
按2.2.2的配方,ｐＨ6.8配制摇瓶培养基,发酵80ｈ,从24～80ｈ每隔8ｈ取样1次,测酶活和ｐＨ值,绘制曲线如图3。酶活在72ｈ处达到高点,为490ｕ/ｍＬ,以后趋平,合适发酵时间可以确定为72ｈ。ｐＨ值在48ｈ以前呈下降趋势,此为菌体生长阶段,由于消耗大量糖产有机酸使ｐＨ下降;56ｈ后ｐＨ与酶活曲线同步上升,56～72ｈ之间出现一段产酶高峰期。
2.2.6 表面活性剂的作用
氨肽酶主要分泌于胞外,表面活性剂能提高细胞膜的透性,使酶容易透过细胞膜分泌出来。实验中采用Ｔｗｅｅｎ80、ＳＤＳ和聚乙二醇(ＰＥＧ6000)3种表面活性剂[9,10],按2.3.5的摇瓶配方,分别按0.05%、0.1%、0.2%三个水平添加,每个水平重复3次。取3次结果的平均值,如表6。
比较结果可以看出,Ｔｗｅｅｎ80对产酶的影响不明显,ＳＤＳ和ＰＥＧ6000能够提高产酶水平,但以ＰＥＧ6000的影响更为显著,其中以0.1%加量的产酶水平最高。ＰＥＧ作用的机理可能是带大量负电荷的ＰＥＧ分子与质膜之间的作用使质膜出现了一些可逆的通道[11],另外,ＰＥＧ分子也可能促进质膜对大分子的转运作用[12]。
3 小结
从已取得的研究结果来看,离子束注入是一种比较有效的新型诱变手段,具有很好的应用价值。本研究通过Ｎ+注入米曲霉Ｗ-05-1,使该菌株的氨肽酶活从272.9ｕ/ｍＬ提高到364.5ｕ/ｍＬ,提高幅度达33.5%。在前述实验条件下,对米曲霉ＷＪ-05-1合适的注入剂量为15.6×1014～20.8×1014ｉｏｎ/ｃｍ2。获得的高产突变株Ｍ60-5-13和Ｍ80-10-7都有较好的遗传稳定性。进一步对Ｍ80-10-7菌株的发酵条件进行了初步优化,使发酵水平提高到647.1ｕ/ｍＬ。最佳碳氮源配方为:麸皮60ｇ/Ｌ,果葡糖浆40ｇ/Ｌ,玉米浆15ｇ/Ｌ;最适起始ｐＨ6.8,最佳发酵时间72ｈ。研究发现该菌利用单糖产酶的效果较好,碳氮比高对产酶有利,表面活性剂ＰＥＧ6000对提高产酶水平有明显效果。
