原果胶酶能够水解不溶性的原果胶为水溶性的果胶物质,这一特性使其在纺织[1]、食品[2]、造纸和环保[3]等领域有着广阔的应用空间。原果胶酶的分离纯化是有效利用原果胶酶、最大限度地发挥其活性的先决条件和基础。在用毕赤酵母原果胶酶工程菌发酵生产原果胶酶时,发酵液中除了含有原果胶酶外,同时还存在酵母自身产生的蛋白质和残留的培养基组分,这些物质严重地影响着原果胶酶的分离纯化,进而也影响着对原果胶酶的进一步深入研究。本试验研究了从毕赤酵母工程菌发酵液中分离纯化原果胶酶的方法,以期为进一步研究原果胶酶的酶学性质、结构及应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
毕赤酵母原果胶酶工程菌X-33/PPN为南京农业大学酶工程研究室构建;培养基BMGY和mB-MMY按照Invitrogen公司的酵母表达手册制备;原果胶参照Sakai等[4]的方法制备;牛血清蛋白BSA购自北京天为时代公司;分子量标准蛋白、丙烯酰胺、双甲基丙烯酰胺、过硫酸铵、十二烷基苯磺酸钠(SDS)、SephadexG75和SepharoseFastFlow均为上海生物工程公司进口分装的Pharmacia产品;考马斯亮蓝R-250购于中国医药集团上海化学试剂公司;其余试剂均为国产分析纯。
1.2 原果胶酶粗酶液的制备
挑取毕赤酵母工程菌X-33/PPN单菌落,接种于装有25mLBMGY培养基的250mL摇瓶中,在30℃、250r/min条件下培养约18h,然后室温下6000r/min离心5min,收集菌体,用mBMMY诱导培养基(约200mL)重新悬浮菌体,使OD600约为1.0;将上述菌液置于1L的摇瓶中,用双层纱布封口,置于30℃、250r/min的摇床上继续培养,每24h向培养基中添加甲醇至其体积分数为1%,诱导培养96h,4℃、6000r/min离心20min。收集上清液,即为原果胶酶粗酶液,于4℃保存备用。
1.3 原果胶酶的分离纯化
1.3.1 原果胶酶粗酶液的浓缩
将盛放原果胶酶粗酶液的透析袋放入培养皿中,加入聚乙二醇6000固体覆盖透析袋,使透析袋中的水分析出,从而使原果胶酶粗酶液浓缩[5]。
1.3.2 原果胶酶粗酶液的硫酸铵沉淀
吸取4℃下保存的浓缩后的原果胶酶粗酶液9份,每份50mL分别装于9个80mL带塞离心管中,分别加入一定量的粉状硫酸铵,使离心管中硫酸铵的饱和度分别为0,20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%和90%,4℃静置过夜,10000r/min离心20min,收集上清液,4℃保存,沉淀用10mL醋酸缓冲液(pH5.8)溶解,然后在同种缓冲液中充分透析,检测上清液和透析处理液中原果胶酶的活性。
1.3.3 SephadexG75凝胶柱洗脱
SephadexG75层析柱的制备参照文献[6]的方法进行。取经硫酸铵沉淀、透析和浓缩后终体积为2mL的原果胶酶液加入到充分平衡的凝胶中,然后用醋酸缓冲液(pH5.8)洗脱,洗脱速度为0.3mL/min,每3min收集一管,测定每管中的蛋白质含量和原果胶酶活性,当检测不到原果胶酶活性时,终止洗脱,并用测得的蛋白质含量和酶活数据绘制凝胶过滤曲线。
1.3.4 离子交换层析
(1)离子交换条件的确定。在6支试管中各吸入1mL供选择的阳离子交换剂,分别用不同pH梯度的缓冲液润洗10次,待离子交换树脂装平稳后,向其中加缓冲液1mL,向各试管中加入100μL经SephadexG75凝胶过滤纯化的原果胶酶溶液,混匀,放置10min,检测上清液中的酶活性,判断是否存在目的蛋白。供选择的pH梯度缓冲液系列有:20mmol/LNaAc-HAc(pH5.5,5.8),50mmol/L磷酸钠缓冲液(pH6.5,7.0)和50mmol/LTris-HCl(pH7.50,8.0)。供选择的3种阳离子交换剂为:SepharoseFastFlow,D151和D152。
(2)原果胶酶的纯化。将经SephadexG75凝胶过滤的样品加入到预先用醋酸缓冲液(pH5.8)平衡好的SepharoseFastFlow阳离子交换层析柱中,首先用醋酸缓冲液(pH5.8)洗脱,洗脱速度为0.5mL/min,然后用0～0.5mol/LNaCl进行线性梯度洗脱,洗脱速度为0.5mL/min,部分收集,每管收集200滴。
1.4 测定项目及方法
1.4.1 原果胶酶活性测定
取10mg原果胶,加入0.95mLpH5.8的NaAc-HAc缓冲液和50μL适当稀释的原果胶酶提纯液,在37℃下保温1h,冰浴以终止反应,10000r/min冷冻离心10min,取上清液,用咔唑-硫酸比色法[7]在530nm波长下测定上清液中的果胶物质。在上述酶反应体系中,每小时催化原果胶生成相当于1μmol半乳糖醛酸的果胶物质的量,定义为一个酶活单位(U)。
1.4.2 蛋白质含量测定
SephadexG75凝胶过滤液和离子交换层析洗脱液中的蛋白质检测均采用280nm紫外分光光度计法[7],蛋白质含量以280nm吸光值(A280)来表示。蛋白质浓度测定采用Braford[8]的方法。
1.4.3 原果胶酶SDS-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳
将上述各步分离纯化的原果胶酶液各取1μg,参照文献[8]的方法进行SDS-PAGE凝胶电泳,鉴定酶的纯度并测定酶的分子质量(m)。
2 结果与分析
2.1 原果胶酶粗酶液的硫酸铵沉淀试验结果
图1表明,随着硫酸铵饱和度的增加,上清液中酶的相对活性不断降低,在饱和度为30%～50%时,上清液中酶活性下降最快,表明原果胶酶沉淀量在相应增大;当硫酸铵饱和度超过70%时,上清液中原果胶酶活性下降呈现出减缓趋势,表明原果胶酶已经基本沉淀完毕。与之相应,在硫酸铵饱和度达到70%时,原果胶酶回收率达到了71.9%,继续提高饱和度,原果胶酶的回收率基本不变。
综合分析硫酸铵沉淀过程中原果胶酶回收率和上清液中原果胶酶活性变化规律可知,选取30%和70%分别作为原果胶酶沉淀起始和终止时的硫酸铵饱和度较为合适。
2.2 SephadexG75凝胶柱洗脱结果
由图2可知,蛋白质含量的洗脱曲线和酶活性的洗脱曲线比较吻合,说明滤液中的蛋白质确实是要分离的原果胶酶。从收集的第17管开始,洗脱蛋白含量增大,同时,洗脱液中原果胶酶的活性升高;到第25管时,洗脱液中蛋白含量和酶活性都达到了最高;到第31管时,洗脱液中的蛋白含量和酶活降到较低水平;继续洗脱,发现在第41管和第45管间出现了第2个活性峰,峰形很小,可能是分泌表达的原果胶酶被酵母细胞产生的蛋白酶降解后的产物形成的,因为含量很低,未作进一步研究。由以上结果可知,酶液经SephadexG75柱洗脱时,收集第17～31管洗脱液,基本可以完全收集到原果胶酶。
2.3 离子交换层析结果
2.3.1 离子交换条件的确定
离子交换层析法是利用不同蛋白质表面电荷的性质不同,来达到分离、纯化蛋白质的目的。进行离子交换层析的最佳溶液pH一般与蛋白质的等电点相差一个单位,这样可使蛋白质的电荷量既能保证将其结合在离子交换树脂上,又不需要在洗脱时采用高离子强度的洗脱液或与原溶液pH相差甚远的pH[8]。根据原果胶酶基因预测原果胶酶的氨基酸组成,可推知原果胶酶的等电点[9],同时考虑到原果胶酶活性测量时反应环境为pH5.8的NaAc-HAc缓冲体系,本试验选用阳离子交换树脂。以D151和D1522种阳离子交换树脂为离子交换剂时,在3种缓冲液体系(pH为5.5～8.0)下,上清液中原果胶酶的相对活性基本达到了97.8%,表明这2种阳离子交换剂均不适合原果胶酶的吸附分离。在3种缓冲液体系(pH为5.5～8.0)下,SepharoseFastFlow阳离子交换剂上清液中的原果胶酶相对活性见表1。
由表1可知,在磷酸和Tris-HCl2种缓冲体系中,上清液中原果胶酶相对活性均较高,表明在这2种缓冲体系中,SepharoseFastFlow对原果胶酶的吸附效果均较差,不适合作为离子交换缓冲液。而在醋酸缓冲体系中,上清液中原果胶酶相对活性较低,表明该阳离子交换剂对原果胶酶的吸附量较大。由表1还可知,在醋酸缓冲液的2种pH条件下,上清液中原果胶酶活性差异不大,但考虑到原果胶酶活性测定的方便性,本试验选用pH为5.8的醋酸缓冲液作为离子交换缓冲体系。
2.3.2 原果胶酶的纯化
从图3可以看出,蛋白质经SepharoseFastFlow离子交换柱被NaCl线性洗脱后,洗脱液中出现了4个蛋白峰和1个活性峰,其中有一个蛋白峰最大,与原果胶酶活性峰一致,表明形成该最大峰的蛋白质为原果胶酶,其他峰则为杂质蛋白。试验结果说明利用0～0.5mol/LNaCl(缓冲体系为NaAc-HAc,pH5.8)溶液线性洗脱离子交换柱,可将原果胶酶和其他杂质蛋白很好地分离开来,从第21～29管洗脱液中可以得到原果胶酶。
2.4 原果胶酶纯度的电泳鉴定及分子质量测定
由图4可知,本试验获得了纯度很高的电泳级原果胶酶。
将本试验测得的原果胶酶的迁移率(0.42093)带入由标准分子质量蛋白电泳所得的分子质量(m)与相对迁移率的回归方程:lgm=-1.0274×Rf+5.0588(图5),计算可得原果胶酶分子质量为43.17ku,与文献[10]报道的结果相一致。
2.5 提纯各步原果胶酶的比活力、纯度和回收率
原果胶酶粗酶液依次经过硫酸铵沉淀、SephadexG75凝胶过滤和SepharoseFastFlow层析,酶的纯度和比活力均有了显著的提高。表2为1L原果胶酶粗酶液各步分离纯化的结果,由表2可知,硫酸铵沉淀适合原果胶酶的粗纯,经过硫酸铵沉淀,酶的比活力提高到1096.35U/mg;SephadexG75凝胶过滤能大幅度地提高原果胶酶纯度,纯化后酶的比活力提高到3762.40U/mg;阳离子交换方法可显著地提高原果胶酶纯度,纯化后酶的比活力为9743.20U/mg,纯度为粗酶液的18.91倍。
3 讨论
国外报道的细菌、霉菌和酵母产生的原果胶酶的纯化方法各不相同,多采用的是将超滤、离子交换树脂Butyl-ToyopearL、Toyopearl和硫酸铵分级沉淀等方法相结合的组合方法[11],也有采用一步纯化获得较好结果的报道[12],这些方法均为从毕赤酵母工程菌发酵液中分离纯化原果胶酶提供了有益的借鉴。尽管毕赤酵母表达的蛋白可以采用镍柱进行亲和层析纯化,但这种方法的成本太高,而且经过亲和层析纯化的蛋白还需去除表达蛋白带有的HIS亲和标签,这无疑增加了纯化过程的复杂程度。本试验借鉴前人纯化微生物原果胶酶的方法,将硫酸铵沉淀、凝胶过滤和离子交换层析3种常规分离方法进行组合,建立了一种成本低廉、纯化效果良好的原果胶酶分离纯化方法,这将有助于进一步研究原果胶酶的酶学性质和高级结构,为原果胶酶的大规模开发利用奠定了基础。
