壳聚糖酶的分离纯化及性质研究
壳聚糖是由2-氨基-Ｄ-葡萄糖(ＧｌｃＮ)和2-乙酰氨基-Ｄ-葡萄糖(ＧｌｃＮＡｃ)通过β-1,4糖苷键连接而成的天然高分子多糖。由于其相对分子量大,分子内强大的氢键引力,壳聚糖不溶于水,在人体内不易被吸收,从而使其应用受到限制。壳聚糖酶(Ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ,ＥＣ3.2.1.132)是一类能水解壳聚糖的水解酶,广泛存在于一些真菌、放线菌、细菌中,在植物、病毒中也发现有此酶的存在[1,4]。壳聚糖经酶水解可形成壳寡糖,具有抑制细菌和真菌生长,调节机体免疫和抗肿瘤等功能[5,7]。由酶法水解壳聚糖制备壳寡糖反应条件温和,生产工艺无污染,产品质量好,受到食品、化学工业、生物医学等领域的青睐。对于壳聚糖酶国内外已有较多的研究报道,包括酶的纯化、理化性质、作用机理、结构功能等。但由于大多数微生物产壳聚糖酶的活性低,生产成本相对较高,一直影响壳寡糖的酶法生产。本实验室利用已有的高活性壳聚糖酶菌株发酵制备壳聚糖酶,开展此壳聚糖酶的纯化及基本性质研究,为该酶应用于壳寡糖的工业化生产提供依据。
1 材料和方法
1.1菌株本实验室保存的ＹＪ02菌株,该菌株可诱导产生高活性的壳聚糖酶。
1.2发酵培养基
ＮＨ4ＮＯ3 1.0%,酵母粉0.4%,Ｋ2ＨＰＯ4 0.07%,ＫＨ2ＰＯ4 0.03%,ＮａＣｌ0.5%,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.05%,葡萄糖0.1%,粉末壳聚糖1%,用1ｍｏｌ/Ｌ ＮａＯＨ/ＨＣｌ溶液调ｐＨ至6.0。
1.3壳聚糖酶发酵液的制备
3.5Ｌ发酵培养基装入5Ｌ的发酵罐中,加入0.1ｍＬ的消泡剂,115℃灭菌30ｍｉｎ,待其冷却后按5%(ｗ/ｖ)的接种量(菌体密达为(1.0～1.4)×107个/ｍＬ)将处于对数生长期的菌种175ｍＬ接种入发酵罐中,进行发酵培养。根据发酵培养条件实验结果,发酵培养条件为:温度30℃,转速100ｒ/ｍｉｎ,ｐＨ=6.0,通气量8Ｌ/ｍｉｎ,定时取发酵液检测壳聚糖酶活力,3ｄ后取下发酵罐,检测酶活力,72ｈ后终止发酵,检测酶活力。
1.4壳聚糖酶的分离纯化
1.4.1壳聚糖酶的分离纯化
将壳聚糖酶发酵液于4℃,5000ｒ/ｍｉｎ离心30ｍｉｎ除菌体,搅拌下向上清液中加入固体硫酸铵分级盐析,取20%～70%盐析沉淀物经ｐＨ=7.5,0.05ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液透析。透析酶液经ＰＥＧ20000浓缩,浓缩液上经ｐＨ=7.5,0.05ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ缓冲液平衡的Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦａｓｔＦｌｏｗ阴离子交换柱(Φ2ｃｍ×10ｃｍ),以0～0.5ｍｏｌ/ＬＮａＣｌｐＨ=7.5,0.05ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ溶液梯度洗脱,流速0.5ｍＬ/ｍｉｎ,检测波长为280ｎｍ,洗脱液分部收集。酶活力部分经ＰＥＧ20000浓缩,用ｐＨ=7.5,0.05ｍｏｌ/ＬＴｒｉｓ ＨＣｌ平衡的ＳｅｐｈａｃｒｙＳ 100凝胶柱(Φ1.6ｃｍ×80ｃｍ)进一步纯化,洗脱流速0.1ｍＬ/ｍｉｎ,收集酶活力组分,冷冻干燥,得纯化壳聚糖酶制品。
1.4.2ＳＤＳ ＰＡＧＥ分析
采用不连续垂直平板电泳系统,对不同纯化步骤的壳聚糖酶进行ＳＤＳ ＰＡＧＥ纯度分析。分离胶浓度为10%,浓缩胶浓度为5%,电泳采用ｐＨ=8.3的Ｔｒｉｓ ＨＣｌ缓冲体系[8]。电泳后考马斯亮蓝Ｒ250染色。
1.4.3壳聚糖酶活力测定[9]
按文献[9]的方法,取0.1ｍＬ壳聚糖酶液加入0.9ｍＬ浓度为1.0%的胶体壳聚糖和1ｍＬｐＨ=5.6的醋酸盐缓冲液,50℃保温反应30ｍｉｎ后,加入ＤＮＳ溶液1.5ｍＬ终止酶反应。沸水浴煮5ｍｉｎ取出冷却,定容至25ｍＬ,5000ｒ/ｍｉｎ离心20ｍｉｎ,取上清液在520ｎｍ处测光吸收值。酶活力单位定义为在上述条件下,每分钟产生1μｍｏｌ还原糖所需的酶量为1个酶活力单位。
1.5壳聚糖酶的性质
1.5.1壳聚糖酶分子量测定
采用不连续ＳＤＳ ＰＡＥＧ电泳,根据样品蛋白质相对迁移距离对照标准蛋白质的相对迁移距离,测定壳聚糖酶相对分子量。
1.5.2温度对壳聚糖酶活力的影响
将酶液与壳聚糖底物分别于25℃,30℃,35℃,40℃,45℃,50℃,55℃,60℃,65℃下反应30ｍｉｎ,测定温度对壳聚糖酶活力的影响。
1.5.3ｐＨ值对壳聚糖酶活力的影响
将酶液与壳聚糖底物分别于ｐＨ=4.6,5.0,5.4,5.6,5.8,6.0,6.2,6.4的0.2ｍｏｌ/Ｌ醋酸盐缓冲液中50℃反应30ｍｉｎ,以1.4.3方法测定酶活力,试验ｐＨ对壳聚糖酶活力的影响。
1.5.4金属离子对壳聚糖酶活力的影响
在酶反应体系中分别加入Ｍｎ2+,Ｍｇ2+,Ｃａ2+,Ｃｕ2+,Ｆｅ3+,Ｈｇ2+,Ｐｂ2+,Ｚｎ2+,使其终浓度分别为0.1ｍｍｏｌ/Ｌ,1ｍｍｏｌ/Ｌ,5ｍｍｏｌ/Ｌ,以1.4.2方法测定酶活力,设不加金属离子组为对照组,测定金属离子对壳聚糖酶活力的影响。
1.5.5小分子有机物对壳聚糖酶活力的影响
在酶反应体系中分别加入ＥＤＴＡ,ＩＡＡ,ＳＤＳ,β-巯基乙醇,使其终浓度分别为0.1ｍｍｏｌ/Ｌ,1ｍｍｏｌ/Ｌ,5ｍｍｏｌ/Ｌ,放置10ｍｉｎ后分别以1.4.2方法测定酶活力,以不加上述物质组为对照,试验各小分子有机物对壳聚糖酶活力产生的影响。
1.5.6壳聚糖酶的底物专一性
分别取1%的壳聚糖醋酸溶液,胶体壳聚糖,羧甲基壳聚糖,胶体甲壳素,羧甲基纤维素钠作为底物反应,测定壳聚糖酶对底物的专一性。
1.5.7米氏常数的测定
0.1ｍＬ酶液分别加入1%的壳聚糖醋酸溶液0.05ｍＬ,0.1ｍＬ,0.2ｍＬ,0.4ｍＬ,0.6ｍＬ,0.8ｍＬ,1.0ｍＬ,加入0.2ｍｏｌ/Ｌ的醋酸盐缓冲液补足2.0ｍＬ,测定酶活力,按Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ Ｂｕｒｋ制图法求其Ｖｍａｘ和Ｋｍ值。
1.6壳聚糖酶制备壳寡糖
1.6.1壳聚糖酶水解壳聚糖制备壳寡糖
取4%的壳聚糖溶液25ｍＬ加入含9Ｕ的壳聚糖酶溶液5ｍＬ,于50℃下搅拌反应12ｈ,加入三氯乙酸(ＴＣＡ)终止反应,4℃下放置过夜,6000ｒ/ｍｉｎ离心30ｍｉｎ以去除酶蛋白沉淀。上清液调节ｐＨ至8.0,50℃减压浓缩至1/3体积,向浓缩物中缓慢加入10倍体积的95%乙醇,沉淀寡糖,离心取沉淀,用无水乙醇重复洗涤脱水3次,抽滤所得寡糖置于真空干燥器中干燥,得壳寡糖制品。
1.6.2壳寡糖的组分分析
将壳寡糖配成10%浓度的水溶液,取1ｍＬ上用氨水(ｐＨ=9.0)平衡的Ｂｉｏ ＧｅｌＰ 4(1.5ｃｍ×110ｃｍ)柱,ｐＨ=9.0的氨水洗脱,流速0.25ｍＬ/ｍｉｎ,检测器波长为210ｎｍ,分部收集洗脱峰样品,和并后冷冻干燥,进行壳寡糖组分分子量测定。
1.6.3壳聚糖酶对不同脱乙酰度壳聚糖底物的水解作用
取脱乙酰度分别为54%,62%,78%,90%的壳聚糖为底物,用过量壳聚糖酶进行充分水解,按1.6.1的方法制备相应的壳寡糖样品,ＨＰＬＣ法分析壳寡糖组分及相对分子量大小。ＨＰＬＣ分析条件为:ＫＳ 801柱,洗脱液0.001ｍｏｌ/Ｌ含0.02%ＮａＮ3的ＮａＯＨ溶液,流速0.5ｍＬ/ｍｉｎ,柱温40℃,壳寡糖质量浓度为0.05%,每次上样20μＬ。
1.6.4壳寡糖分子量测定
将酶水解制备的寡糖样品和经柱分离纯化的壳寡糖样品充分干燥后采用乙酰丙酮法测定壳寡糖的数均分子量[10]。
2 结果
2.1壳聚糖酶的纯化
经20%～70%硫酸铵分级盐析的酶蛋白,透析脱盐后经Ｑ ＳｅｐｈａｒｏｓｅＦＦ阴离子交换柱纯化,结果见图1和图3。可以看出经本步骤一次分离可将大部分的杂蛋白除去,所得到的壳聚糖酶活性部分收集再经ＳｅｐｈａｃｒｙＳ 100凝胶柱分离纯化,结果见图2、图3,ＳＤＳ ＰＡＧＥ电泳显示为单条带。壳聚糖酶发酵液经过一系列的分离纯化,得到电泳纯壳聚糖酶,纯化达29倍,收率为47.6%,分离纯化步骤与结果见表1。
2.2壳聚糖酶的性质
2.2.1壳聚糖酶分子量
以分离纯化的壳聚糖酶经ＳＤＳ 聚丙烯酰胺凝胶电泳,电泳区带与标准蛋白质区带比较,以相对迁移率对分子量对数作图,本壳聚糖酶的分子量为66.2ｋＤａ。
2.2.2温度对壳聚糖酶活力的影响
该壳聚糖酶在ｐＨ5.6的醋酸缓冲体系中反应30ｍｉｎ时,酶活力随反应温度的升高而增加,50℃酶活力达到最高。温度超过50℃时,随反应温度的增高,酶活力下降,见图4。
2.2.3ｐＨ对壳聚糖酶活力的影响
ｐＨ对酶活力的影响见图5,酶活力随着反应体系ｐＨ的升高而增加,最适ｐＨ为6.0,当ｐＨ超过6.0以后,酶活力逐渐下降。
2.2.4金属离子和小分子有机物质对壳聚糖酶活力的影响
不同金属离子对酶活力的影响见图6,Ｍｎ2+对酶活力有明显促进作用,可使酶活力提高到1.2倍;Ｃｕ2+,Ｆｅ3+,Ｈｇ2+对酶有不同程度的抑制作用,其中5ｍｍｏｌ/ＬＦｅ3+,Ｈｇ2+完全抑制酶活性。ＩＡＡ和β-巯基乙醇的适量加入对酶稍有促进作用,5ｍｍｏｌ/Ｌβ-巯基乙醇的加入可使酶活力提高到1.3倍,而ＥＤＴＡ和ＳＤＳ对酶有抑制作用(见图7)。
2.2.5壳聚糖酶对底物水解的专一性
壳聚糖酶对壳聚糖醋酸水溶液,有很好的水解活性,而对羧甲基壳聚糖,胶体甲壳素,羧甲基纤维素钠则没有降解作用,说明壳聚糖酶对底物有较强的底物专一性。
2.2.6壳聚糖酶动力学分析
根据不同底物浓度对酶促反应的关系,采用双倒数作图法(见图8)可以得到Ｋｍ为64ｍｍｏｌ/Ｌ,Ｖｍａｘ为4.1μｍｏｌ/ｍｉｎ。
2.3壳聚糖酶对壳聚糖的降解作用
壳聚糖经壳聚糖酶水解后,经ＢｉｏｇｅｌＰ 4柱分离,结果如图9所示,洗脱曲线显示4个主峰,分别收集各峰,减压浓缩,冷冻干燥分离物。用乙酰丙酮法测得各峰的数均分子量分别为4011Ｄａ,3123Ｄａ,2906Ｄａ,1378Ｄａ,未经柱分离的酶水解产物壳寡糖的数均分子量为2400Ｄａ。由此推测第1个峰的寡糖聚合度在20以上,第2,3峰的聚合度在10～20,第4个峰的寡糖的聚合度在10以下,10个聚合度左右的糖占大多数。
2.4壳聚糖酶对不同脱乙酰度壳聚糖的水解作用
不同脱乙酰度的壳聚糖经壳聚糖酶水解后得到的壳寡糖,进行ＨＰＬＣ分析,结果见图10～13。由图可见随着脱乙酰度的增大,其酶水解产物的数均分子量逐渐降低,表现在ＨＰＬＣ谱图显示的糖保留时间为10～12ｍｉｎ的峰面积逐渐缩小,保留时间为12～14ｍｉｎ和14～16ｍｉｎ的峰面积逐渐增大。另外此酶对甲壳素没有明显的降解作用。由此推测乙酰基的存在不利于酶解反应的进行,因此该壳聚糖酶的其酶水解位点可能为ＮＧｌｃ ＮＧｌｃ。
3 讨论
50℃酶活力达到最高。温度超过50℃时,随反应温度的增高,酶活力下降。此次研究的壳聚糖酶不耐高温,在本实验研究条件下其最适酶解温度为50℃,随温度的升高,特别温度高于60℃,则酶活力下降较快。而有的壳聚糖酶在此条件下,酶活力可保持不变,如Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.ｓｔｒａｉｎＣＫ4的壳聚糖酶的耐热性很高,60℃处理30ｍｉｎ仍然能保持全部酶活性,80℃处理30ｍｉｎ和60ｍｉｎ后剩余酶活力分别为85%,66%,只有在90℃处理60ｍｉｎ后酶才完全失活[11]。所以在保存这种壳聚糖酶时,需要在低温环境下,在4℃下15ｄ,壳聚糖酶活力基本保持不变。在利用该壳聚糖酶酶解壳聚糖制备壳寡糖时,作者选择的酶解温度为50℃,以使该酶可在较长的时间内保持活性。此壳聚糖酶对ｐＨ没有特别的要求,与一般的壳聚糖酶相似,在自然ｐＨ条件下具有最适的酶活力,当ｐＨ<5时,酶活力很低。研究还发现,Ｍｎ2+对酶有激活作用,而Ｆｅ3+,Ｈｇ2+和Ｃｕ2+对酶有抑制作用,这与其它许多壳聚糖酶的性质相似[12]。ＥＤＴＡ抑制酶活力,表明酶反应需要有一定金属离子参与。ＩＡＡ和β-巯基乙醇不仅不抑制酶活力反而有促进作用,推测一些蛋白变性剂的存在可能对酶的活性中心有影响,原先酶的活性中心的结构与底物不容易结合,当对此活性中心稍加改变时反而使酶活力增加,这有待于进一步研究。壳聚糖酶根据其作用位点不同,可分为3类:第一类是可以水解ＧｌｃＮ ＧｌｃＮ键及ＧｌｃＮＡｃ Ｇ1ｃＮ键的壳聚糖酶,如来自Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｓｐ.Ｎ174的壳聚糖酶;第二类只能水解Ｇ1ｃＮ ＧｌｃＮ键,产生这一类酶的代表菌株有Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ.Ｎｏ.7 Ｍ;第三类既可水解Ｇ1ｃＮ ＧｌｃＮ键又可水解Ｇ1ｃＮ ＧｌｃＮＡｃ键,产菌菌株包括Ｂ.ｃｉｒｃｕｌａｎｓＭＨＫ1。所有壳聚糖酶有1个共同性质就是要求糖苷键的一侧至少有1个Ｇ1ｃＮ残基,而不能催化ＧｌｃＮＡｃ Ｇ1ｃＮＡｃ键的断裂[13]。本试验研究了不同脱乙酰度壳聚糖对酶解产物的影响,结果表明该壳聚糖酶的作用位点很可能是ＧｌｃＮ ＧｌｃＮ键。本文所研究的壳聚糖酶属于胞外壳聚糖诱导酶,它的酶活力比现有所报道壳聚糖酶最高酶活力250.2Ｕ/ｍｇ高5倍[14],因此对应用于工业生产有一定的价值。该壳聚糖酶分子量为66.2ＫＤ,具有底物专一性,酶解壳聚糖制备的壳寡糖为类白色至淡黄色粉末,无味,数均分子量为2400Ｄａ,在碱性条件下水溶性好。国外对于壳聚糖酶的研究已经深入到分子水平,国内这方面的工作开展的不多。在接下来的工作中,可以通过序列分析或基因克隆从分子水平上对该壳聚糖酶进行研究,充分了解其催化机理和特性,为利用该酶降解壳聚糖制备寡糖提供更加丰富的理论基础和研究依据。
