0 前言
木聚糖是植物细胞壁中的主要组分,它由β-Ｄ吡喃型木糖残基经β-1,4糖苷键相连形成主链,并由阿拉伯糖、乙酰基甘露糖和葡萄糖醛酸等复杂侧链组成[1,2].木聚糖酶(内切-1,4-β木聚糖酶)和β-木糖苷酶是木聚糖分解酶系统的主要成分,它们能将木聚糖转变成一个更容易被生物利用的形式[3].木聚糖酶是一种重要的工业用酶,广泛用于饲料、食品和酿造工业.自从发现木聚糖酶可以用于纸浆的漂白以后,木聚糖酶越来越引起国内外的关注,这是因为木聚糖酶对纸浆进行预处理后,可减少后续漂白过程中氯化物的用量,从而降低制浆和造纸工业对环境造成的污染[45].芽孢杆菌能适应极端的生长环境,再加之芽孢杆菌产木聚糖的基因工程研究较为成熟,因此,芽孢杆菌木聚糖酶的研究较具潜力.笔者参照国内外关于木聚糖酶研究的成果,利用单因素和正交试验,研究了枯草芽孢在液体发酵时的产酶条件.
1 材料与方法
1.1 菌种枯草芽孢杆菌(BacillussubtilisCCIC10090),购于中国工业微生物菌种保藏中心.
1.2 材料
1.2.1 阿拉伯木聚糖的制备[68]麸皮→清洗→淀粉酶、蛋白酶水解离心→过滤→固体残留物→2%的碱性Ｈ2Ｏ2溶液处理→2.0mol/LＨＣｌ中和→离心→上清液→超滤→95%乙醇沉淀→成品.
1.2.2 发酵培养基[9]麸皮4%,蛋白胨0.5%,酵母膏0.5%,Ｋ2ＨＰＯ40.1%,ＭｇＳＯ4·7Ｈ2Ｏ0.02%,ｐＨ8.5.
1.3 粗酶液的制备经液态发酵后的培养液在4℃条件下离心(9000ｒ/min,15min),上清液即为粗酶液.
1.4 木聚糖酶活力测定[10]取粗酶液0.2ｍＬ,0.5%的木聚糖(0.05mol/L,ｐＨ9的Ｇｌｙ-ＮａＯＨ缓冲溶液配制)0.8ｍＬ于试管中,混匀,40℃水浴中保温10min后,以ＤＮＳ法测定还原糖(以木糖为标准).酶活单位:在上述条件下每分钟产生等量于1μmol木糖的酶量为1个活力单位.以灭活酶液为对照.
2 结果与讨论
2.1 碳源对枯草芽孢杆菌产酶的影响
2.1.1 碳源种类对产酶的影响枯草芽孢杆菌在不同的碳源培养基中,产酶能力有所不同,如图1所示.以木糖、燕麦木聚糖和自制麸皮木聚糖为碳源时,只能产较低的酶活力,采用麸皮为培养基时,酶活达到最大.这与以前报道的关于产木聚糖酶的芽孢杆菌所能利用的碳源有所不同,芽孢杆菌ＮＴ9[11]和芽孢杆菌ＢＰ7[12]以木糖为培养基时,木聚糖酶活最大;细菌ＨＮＸ01[13]和芽孢杆菌ＳＰＳ0[14]在利用自制的麸皮木聚糖时,木聚糖酶活最高;枯草芽孢杆菌[15]在以麸皮为碳源的条件下,酶活比较低,而在以燕麦木聚糖作为碳源时,酶活达到最大.
2.1.2 碳源含量对产酶的影响采用4%、5%和6%的麸皮作碳源时,发酵产酶能力变化不很大,采用1%和2%低含量的麸皮,对枯草芽孢杆菌产酶能力有较大的影响,如图2所示.
2.2 氮源对产酶的影响
2.2.1 单一氮源对产酶的影响
在产酶基础培养基中,以4%的麸皮为碳源,再添加0.5%不同单一碳源,从图3可知,磷酸氢二铵为产酶的良好无机氮源,蛋白胨为产酶的良好有机氮源,ＫＮＯ3作为氮源产木聚糖酶比较低.
2.2.2 复合氮源对产酶的影响
以最佳氮(0.5%磷酸氢二铵)为对照,再以0.25%磷酸氢二铵加0.25%的其他几种氮源进行实验,结果如图4表明,复合氮源没有引起酶活的增加.
2.3 添加物对产酶的影响
在培养基中分别添加1ｍmol/L的几种金属离子、吐温、二硫苏糖醇(ＤＴＴ)、2巯基乙醇,并以不加任何添加物作为对照,结果如表1所示:Ｆｅ2+、Ｍｇ2+和Ｚｎ2+对产木聚糖酶有促进作用,酶活分别比以前没有添加这些金属离子增加了19%、16%和7%;Ｃｕ2+对产木聚糖酶具有较强的抑制作用,酶活下降了51%;Ｆｅ3+和Ｍｎ2+对产木聚糖酶没有太大的影响,它们对产酶只有少许的抑制作用;吐温是一种很好的能增加酶活的添加剂,酶活比没有添加吐温增加了24%,主要原因是因为吐温是一种表面活性剂,能改变细胞膜通透性,提高木聚糖酶的分泌和稳定性[11];二硫苏糖醇和2巯基乙醇对提高产酶有很好的效果,这可能是它们具有抵消半胱氨酸残基中的Ｓ—Ｓ氧化作用,因此稳定了木聚糖酶[15,16],添加能增加酶活大约1.3倍.
2.4 正交试验
2.4.1 因素水平表
为了获得枯草芽孢最佳的产酶培养条件,在初步研究碳源和氮源等对产酶影响的基础上,按正交实验分配表做5因素4水平的正交综合实验,5因素4水平的设置见表2.
2.4.2 正交试验结果
根据正交表Ｌ16(45),做正交试验,结果见表3.
2.4.3 结果分析
从表3中极差Ｒ值可以看出,5因素影响菌株枯草芽孢杆菌产木聚糖酶的主次顺序为Ｄ>Ｃ>Ｂ>Ａ>Ｅ,由各列各相应位级的酶活力之和可知,Ａ2Ｂ2Ｃ2Ｄ3Ｅ3为优势组合.从效应曲线图(图略)可以看出:培养时间对产酶影响比较大,在48ｈ,酶活力值达到最大,低于或高于这个值对产酶都有比较明显的影响,这表明,时间过长或过短都不利于酶的产生;培养温度在35～40℃和ｐＨ在8～9对产酶都没太大的变化,但超过这个范围将有比较大的影响;氮源和接种量对酶活影响不大.
3 结论
通过单因素试验和正交试验,得到了最优的产酶培养条件,其最适条件为:2%麸皮、0.5%(ＮＨ4)2ＨＰＯ4、0.02%ＭｇＳＯ4·2Ｈ2Ｏ、0.1%Ｋ2ＨＰＯ4、0.2%吐温80、1ｍmol/L微量元素(Ｆｅ2+,Ｚｎ2+)、接种量为4%、ｐＨ9.0、35℃和振荡培养48ｈ.在上述培养条件下,经过4个平行验证试验,其平均酶活可达到2.67ＩＵ/ｍＬ,酶活提高显著.
