纳豆激酶是一种枯草杆菌蛋白激酶(nattoki—nase)，是纳豆发酵过程中由纳豆枯草杆菌(Bacillus subtilis natto)产生的一种具有纤溶活性的丝氨酸蛋白酶(单链多肽酶)? 。1987年由日本的须见洋行等首先发现的 ]。由于具有无毒副作用，体内半衰期长，成本低廉等其他溶栓剂无法比拟的优点，有潜力成为新一代抗栓药物 J。Nadamura等于1992年测定了纳豆激酶基因的核苷酸序列使得用基因工程技术提高纳豆激酶活性及产量成为可能[ ]。目前。通过重组DNA技术获得目的基因和表达产物已成为一种有效的技术手段。国外研究者们在NK基因的表达系统上做了一些尝试，主要以原核表达系统为主 。对于真核表达系统的报道的很少。巴斯德毕赤
酵母作为一种真核表达系统，同时具有真核表达系统的优势及原核表达系统的快速、操作方便和廉价的特点。它不仅具有其他酵母分子及基因复制功能，而且其表达外源基因的水平高于其他酵母1O～100倍，因此它作为一种蛋白表达系统已得到越来越广泛的应用[ ，加]。纳豆激酶的活性测定方法有[¨】：纤维蛋白平板法、凝块溶解时间法(CLT法)、四肽底物法、血清板法和三明治式酶联免疫吸附法(ELISA)。本文作者利用在纤维蛋白平板法基础上进行改造的纤维蛋白原一琼脂糖平板法。筛选具有纳豆激酶活性的基因工程酵母菌。
1 材 料
1．1 菌 种
重组纳豆激酶工程酵母菌(Gsll5／NK)(由张教授提供)，巴斯德毕赤酵母(P．pastorisGs115)(购自Invitrogen公司)。
1．2 药 品
纤维蛋白原(74 mg／支)，购自中国生物制品鉴定所；凝血酶(210BP／支)，购自中国生物制品鉴定所；标准尿激酶，购自中国生物制品鉴定所；生物素(进口分装)。其余试剂均为分析纯或生物
制剂。
1．3
培养基
MD培养基：800 mL蒸馏水高压灭菌20 min后，依次加入下列溶液：100 mL的13．4％ YNB，100 mL的20％葡萄糖，2 mL的0．2％ 的生物素。4℃保存。
重组酵母生长培养基：葡萄糖，2％ ；蛋白胨，1．5％ ；KC1，0．05％ ；MgSO4‘7H2O，0．05％ ；MnSO4‘7H2O，0．003％ ；FeSO4‘7H20，0．003％ ；pH 5．5。
重组酵母发酵培养基：以2％(体积分数)甲醇替代生长培养基中的葡萄糖，其余同生长培养基
2 方 法
2．1 重组纳豆激酶组氨酸野生型酵母的筛选将涂布有酵母转化子(含空载体pPIC9K与含重组载体pPIC9K／NK)的MD(不含组氨酸)平板(转化平板)于28～30℃ 倒置培养2 d，至菌落出现。以未转化的工程菌P．pastoris Gsl15为阴性对照。由此检测His 转化子。
2．2 单菌落
菌种筛选
(1)从转化平板接单菌落于MD斜面。
(2)挑取转化平板中大菌落分离单菌落。添加
抗生素于MD培养：在MD培养基中添加4个梯度的氨苄
青霉素培养，分别为：20、40、60、80~g／mL氨苄青霉素，挑取原平板中大菌落于其中，并置于28℃ ，200转摇床中培养。
平板划线分离：利用平板划线分离法分离原平板中大菌落。
浇注分离法：利用浇注分离法对划线平板菌落进一步分离单菌落待浇注。平板表面长出菌落后，转接于MD斜面。
2．3 重组纳豆激酶工程菌的发酵
2．3．1 纳豆激酶活性的测定[2]0．05 moI／L pH7．8的巴比妥钠缓冲液的配制：向331 mL 0．1 mol／L巴比妥钠溶液中加入169 mL 0．1 mol／L盐酸，然后用160 mL水稀释，即为pH 7．8的巴比妥钠缓冲液。
纤维蛋白平板的制备：将纤维蛋白原(60 mg)溶于pH 7．8的巴比妥钠缓冲液中(24 mL)，配制2．5 mg／mL的纤维蛋白原缓冲液液；同时将凝血酶(210BP)溶于7 mL pH 7．8的巴比妥钠缓冲液中，配制30 BP／mL的凝血酶缓冲液。取直径为6．5 cm 的无菌平皿，置于水平操作台内，向其中加入6 mL的纤维蛋白缓冲液，加入0．3 mL的30 BP凝血酶缓冲液液，小心振荡使之混匀，室温过夜．使之生成乳白色薄层．一般现用现制，以防污染。纤维蛋白原一琼脂平板的制备：10 mL l％的琼脂糖于58～66℃ 中加入40～45℃ 的3 mL4 mg／mL(74 mg纤维蛋白原溶于18．5 mL pH7．8的巴比妥钠缓冲液中，即为4 mg／mL纤维蛋白原缓冲液)的纤维蛋白缓冲液迅速混匀倒入事先放入0．5 mL的凝血酶(30 BP／mL)缓冲液，并立即混匀，静置冷却。1 h后，用直径为3 mm 的无菌塑料吸管在平板上打孑L。重组纳豆激酶酵母菌活性的测定：取重组纳豆激酶酵母菌发酵液10～50 L，点于纤维蛋白原一琼脂平板孔中(纤维蛋白平板上)，室温静置10 min后，放入37℃恒温箱中18 h，测定溶圈直径。
2．3．2 重组纳豆激酶工程菌发酵筛选
将斜面中单菌落重组酵母经活化后接入50 mL生长培养基中，27．5℃ ，200 r／min，培养45 h，离心收集菌体，再加入50 mL发酵培养基，27．5℃ ，200 r／rain，发酵诱导。在诱导过程中，每隔24 h取一次样，做试管溶栓试验(取1．5 mL发酵液于干净试管中，将小块血栓放入其中，并于37℃ 恒温箱中，视其溶栓情况)，将能够溶解血栓的发酵液点平板，视透明圈。
2．4 重组纳豆激酶工程酵母发酵条件研究
重组酵母生长培养基G含量为2％，配不同甲醇含量的重组酵母发酵培养基，甲醇含量分别为1．5％ 、2％ 、2．5％。重组酵母接人生长培养基培养45 h后离心，转入发酵培养基诱导发酵。每隔24 h取样1 mL。最后，将所取样品点纤维蛋白原一琼脂平板视透明圈。
3 结果与讨论
3．1 重组酵母的组氨酸野生型筛选
pPIC9K具有组氨酸脱氢酶基因(HIS4)可以在MD培养基上生长，而巴斯德毕赤酵母属于组氨酸缺陷型不能在MD培养基上生长，所以转化平板上生长的白色菌落即是转化成功的重组酵母的组氨酸野生型。按方法2．1筛选组氨酸野生型，结果对照(P．pa toris Gsl15)无菌落生成，转化平板则长出白色菌落，即重组酵母的组氨酸野生型。
3．2 重组纳豆激酶工程酵母菌筛选
按方法2．3．2筛选重组纳豆激酶工程酵母菌，将20肛L发酵液点纤维蛋白平板按方法2．3．1测其活性，共筛出5株工程菌，分别为Gs115／NK01、Gs115 K02、Gsl15 K03、GS115 K06、C~115／NK08，其溶圈直径如表1所示。
按2．3．1中的方法制备纤维蛋白原．琼脂平板Gs115 K01、Gs115／NK02、Gs115／NK03、Gsl15／NK06、Gs115／NK08重新发酵测其纤溶活性，结果见表2。
纤维蛋白平板法和纤维蛋白原一琼脂平板法所测的纳豆激酶工程酵母的溶圈直径基本一致，故此2种方法都可以用来测纳豆激酶工程酵母的酶活性。但纤维蛋白平板溶解后，如果纳豆激酶活性很大，平板内会充水影响溶圈的形状，甚至整个平板变为液体，无法测其活性。故本实验采用纤维蛋白原．琼脂平板法。
3．3 重组纳豆激酶工程酵母菌发酵条件
按方法2．4确定Gsl15／NK01、Gsl15／NK08最适甲醇诱导浓度，按2．3．1纤维蛋白原一琼脂平板法测其不同培养时间的活性，如表3所示。
由以上数据可知：重组纳豆激酶工程酵母菌最佳甲醇诱导浓度为2％，且发酵96 h后酶活达到高峰。
3 结 论
(1)根据Gsl15为甲醇缺陷型的性质，筛选出重组酵母的组氨酸野生型。
(2)利用平板划线分离法和浇注分离法分离出重组纳豆激酶工程酵母菌单菌落。
(3)通过纤维蛋白平板法筛选出5株纳豆激酶活性比较高的重组工程酵母菌，分别为Gsl15／NK01、 Gs115／NK02、 Gs115／NK03、Gsl15／NK06、Gs115／NK08。
(4)经过发酵条件研究，初步确定重组纳豆激酶工程酵母菌的最佳甲醇诱导浓度为2％且于96 h酶活达到高峰。
