果胶酶是分解果胶物质的一类酶的总称。在20世纪30年代,美国就已将果胶酶用于果汁的澄清。之后,果胶酶的应用范围得到不断拓展,诸如麻类脱胶[1]、木材防腐[2]、果酒澄清[3]、胃石症的临床治疗[4]等。果胶酶还被用于研究制取功能性寡糖,并且随着植物病理学研究的深入,果胶酶及其水解物应用于植物诱导抗病的研究报道[5,6]也日渐增多。目前,果胶酶已成为重点开发生产的五大工业酶制剂之一。商品用果胶酶是多种酶混合的酶制剂,其中起主要作用的是果胶内切酶。通常所说的果胶内切酶(ＥＳ3.2.1.15),是指内切多聚半乳糖醛酸酶,简称ｅｎｄｏ ＰＧ。这种酶能水解果胶酸和聚半乳糖醛酸,产物是单乳糖醛酸、双乳糖醛酸和寡聚乳糖醛酸。果胶内切酶普遍存在于植物和微生物中,但天然来源的果胶内切酶分泌量低且提取困难,难以满足现实实验、生产的需要,因此,人工筛选果胶内切酶产生菌株对果胶酶工业生产与实验具有十分重要的意义。国内有关果胶内切酶的研究多偏向于应用方面,对果胶内切酶产生菌的研究不是很多。本文作者进行了果胶内切酶产生菌的筛选工作,同时对所获得的果胶内切酶高产酶菌株的产酶条件进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 分离材料
腐烂水果;果园泥土,大连旅顺;大曲,长春榆树大曲(集团)股份有限公司。
1.1.2 培养基
(1)富集培养基
麦汁平板培养基:麦汁100ｍＬ,琼脂2ｇ。
合成培养基[7]:葡萄糖,20ｇ;ＫＨ2ＰＯ4,1ｇ;ＭｇＳＯ4,0.5ｇ;ＦｅＳＯ4,0.02ｇ;ＭｎＳＯ4,0.01ｇ;ＺｎＳＯ4,0.02ｇ;酵母膏,0.1ｇ;琼脂,20ｇ;加水至1Ｌ。
(2)分离培养基[8]Ｋ2ＨＰＯ4,0.1ｇ;ＭｇＳＯ4,0.5ｇ;ＮａＮＯ3,3ｇ;ＦｅＳＯ4,0.01ｇ;果胶,2ｇ;琼脂粉,15ｇ;加水至1Ｌ,起始ｐＨ7.0。
(3)产酶发酵培养基酵母膏,1%;Ｋ2ＨＰＯ4,0.1%;淀粉,2%;桔皮粉浸出物,2%;ｐＨ,7.0。
(4)鉴定用主要培养基
葡萄糖琼脂培养基:蛋白胨,10ｇ;ＮａＣｌ,5ｇ;牛肉膏,5ｇ;葡萄糖,10ｇ;琼脂,20ｇ;水,1Ｌ;ｐＨ7.2。
葡萄糖蛋白胨培养基(ＭＲ和ＶＰ试验用):葡萄糖,5ｇ;蛋白胨,5ｇ;Ｋ2ＨＰＯ4,5ｇ;蒸馏水ｌＬ;ｐＨ,7.2～7.4。
另有:7%ＮａＣｌ营养肉汤培养基,5%ＮａＣｌ营养肉汤培养基,葡萄糖发酵培养基,淀粉培养基,硝酸盐还原试验培养基,石蕊牛奶培养基等。
1.2 方法
1.2.1 菌种筛选
筛选路线:采样→增殖(富集)培养→初筛→复筛。
1.2.2 粗酶液的提取
菌体接种于发酵培养基上28～30℃培养3ｄ,3ｋｒ/ｍｉｎ离心10ｍｉｎ,上清液即为粗酶液。
1.2.3 酶活力的测定方法
外切酶活力测定采用ＤＮＳ法[9],内切酶活力测定采用粘度下降法[10]。
2 结果与讨论
2.1 果胶内切酶产生菌株筛选结果
2.1.1 初筛结果
采用平板稀释法分离,将在果胶为唯一碳源平板上生长的单菌落,接种于果胶斜面培养基,置于28～30℃培养。然后将斜面培养的菌接入果胶平板上,置于28～30℃培养。采用刚果红平板染色,筛选出有透明圈的菌,即为果胶酶产生菌。本研究筛选出6株菌,命名为ＧＪ-1、ＧＪ-2、ＧＪ-3、ＧＪ-4、ＧＪ-5和ＧＪ-6。通过观察菌落和水解圈的大小可初步确定ＧＪ-1和ＧＪ-3的果胶酶活力较高。平板菌落和镜下观察ＧＪ-1为细菌。
2.1.2 复筛结果
将初筛得到的菌株进行产酶发酵,提取粗酶液,测定果胶酶活力。结果见表1。由表1可见,ＧＪ-1的果胶内切酶和外切酶的活力均最高,即ＧＪ-1的果胶酶活力最高。复筛结果与初筛结果一致。确定ＧＪ-1为果胶酶产生菌的出发菌株。
2.2 菌株ＧＪ-1产酶的发酵条件
2.2.1 初始ｐＨ对ＧＪ-1菌体生长及产酶的影响
采用产酶培养基,将初始ｐＨ调至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,30℃间歇培养72ｈ,测定菌体浓度和果胶内切酶活力,结果见图2。菌株ＧＪ-1生长ｐＨ为5.0～8.0,最适生长和产酶ｐＨ为7.0。
2.2.2 温度对ＧＪ-1菌体生长及产酶的影响
采用产酶培养基,将初始ｐＨ调至7.0,在15、20、25、30、35、40、45、50℃间歇培养40ｈ,测定菌体浓度和果胶内切酶活力,结果见图3。菌株ＧＪ-1在15～45℃内生长,最适生长温度和产酶30～35℃。
2.2.3 菌体ＧＪ-1产酶培养基的优化
为了解碳源对产酶的影响,采用1%碳源,其他条件同生产培养基,30℃间歇培养48～72ｈ,测定菌体浓度和果胶内切酶活力。结果显示,ＧＪ-1以玉米粉、淀粉、果胶、麸皮作碳源时产果胶内切酶活力较高。综合考虑,选定玉米粉和麸皮作碳源进行酶发酵。为了解氮源对产酶的影响,采用1%氮源,其他条件同生产培养基,30℃间歇培养48～72ｈ,测定菌体浓度和果胶内切酶活力。结果显示,ＧＪ-1以蛋白胨、酵母膏、牛肉膏、麸皮、(ＮＨ4)2ＳＯ4作氮源时产果胶内切酶活力较高。综合考虑,选定麸皮和(ＮＨ4)2ＳＯ4作氮源进行酶发酵。为合理确定碳源、碳源浓度,选择玉米粉、麸皮、(ＮＨ4)2ＳＯ4进行Ｌ9(33)正交实验。结果显示,麸皮对菌体ＧＪ-1生长和产酶影响较大,玉米粉和(ＮＨ4)2ＳＯ4影响不大。发酵培养基最佳组合为麸皮3%,(ＮＨ4)2ＳＯ41%,玉米粉2%。
2.2.4 酶发酵时间的确定
采用优化后培养基(麸皮3%,(ＮＨ4)2ＳＯ41%,玉米粉2%,ｐＨ7.0)30℃间歇发酵,不同时间测定菌体浓度和果胶内切酶活力,结果见图4。由图4可知,菌体生长在24ｈ达到最大,果胶内切酶活力在36ｈ达到最大。
3 结论
以腐烂水果、果园泥土、大曲等为分离材料,筛选得到了果胶内切酶高产菌株ＧＪ-1。观察菌落形态和镜下形态,确定菌株ＧＪ-1为细菌。对菌株ＧＪ-1进行发酵培养,并通过正交实验确定了适宜菌株ＧＪ-1产酶的最佳培养基组成:ρ(麸皮)=30ｇ/Ｌ,ρ[(ＮＨ4)2ＳＯ4]=10ｇ/Ｌ,ρ(玉米粉)=20ｇ/Ｌ。菌株ＧＪ-1的最适产酶条件为:初始ｐＨ值7.0,温度30℃,时间36ｈ。
编者另注：
3, 5－二硝基水杨酸试剂（DNS试剂）：
甲液： 溶解6.9 g苯酚于15.2 ml 10％氢氧化钠中，并稀释至69 ml，在此溶液中加入6.9 g亚硫酸氢钠。
乙液： 称取22.5 g酒石酸钾钠，加到300 ml 10％氢氧化钠溶液中，再加入880 ml1％的3、5－二硝基水杨酸溶液。
将甲液与乙液相混合即得黄色试剂，贮于棕色试剂瓶中，放置7－10天以后使用。
