单宁酶 Ｔａｎｎａｓｅ ｏｒ Ｔａｎｎｉｎ ａｃｙｌ ｈｙｄｒｏｌａｓｅＥＣ3.1.1.20 是一种水解酶 它能够水解单宁的酯键和缩酚酸键最终生成没食子酸和葡萄糖 及水解没食子酸甲酯之类的物质但对酯基具有专一性[3 4]。据报道黑曲霉 米曲霉 酵母等[1 2 3]也能合成单宁酶 许多 报道认为单宁酶为一诱导酶只有当单宁浓度达到一 定值时才被诱导合成单宁酶在饮料业、啤酒业、饲料加工业、化妆品工业 皮革加工业以及制备没食子酸丙酯等抗氧化剂方面有重要的应用价值是一种用途较广的酶[1]。本研究用正交优选法对液态发酵生产 单宁酶的条件进行了优化，也探索了菌丝生长与产酶的关系，为今后开发生产单宁酶作了以下的研究工作。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 供试菌种
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ.ｎｉｇｅｒ Ｎｏ.3 湖南农业大学食品科技学院微生物教研室提供
1.1.2 菌种保存培养基
单宁 0.5％ 葡萄糖 1.0％ ＮＨ4ＮＯ3 0.15％，Ｋ2ＨＰＯ4 0.1％ ＭｇＳＯ47Ｈ2Ｏ 0.05％ ＫＣｌ0.05％ ＦｅＳＯ4 0.001％ ｐＨ6.0
1.1.3 液体发酵培养基
经过培养基优选试验确定
1.2 试验方法
1.2.1 可溶性蛋白质含量测定
考马斯亮蓝Ｇ－250法 用牛血清白蛋白作为标准ＢＡＳ 经过微量凯氏定氮法校正
1.2.2 酶活力测定
根据Ｉｉｂｕｃｈｉ测定单宁酶活力方法测定[1，4]:将单宁酶在ｐＨ5.0条件下,每小时转化1 ｍｏｌＰＧ所需要的酶量定义为一个酶活力单位 Ｕ
1.2.3 菌丝生物量 湿重 的测定[5]
液体发酵三天的菌丝经过四层纱布过滤或双层尼龙布过滤,用蒸馏水洗涤菌丝至洗出液为无色,然后用滤纸吸去菌丝表面所吸附的水分,再在天平上称重
1.2.4 粗酶液的提取
取在冰箱中预冷的菌丝，研钵和0.01ｍｏｌ，ｐＨ5.0的柠檬酸缓冲液，并依次按1：1：5的比例加到研钵中,在冰浴中研磨10ｍｉｎ,在4℃下静置抽提1ｈ 高速冷冻离心机4℃下1500ｘｇ离心50ｍｉｎ,上清液转入50ｍｌ容量瓶中,用酶提取缓冲液定容至刻度.
1.2.5 黑曲霉 Ａｓｐ.ｎｉｇｅｒ Ｎｏ.3 接种与培养条件
将活化的Ａｓｐ.ｎｉｇｅｒ Ｎｏ.3孢子用10ｍｌ无菌生理盐水洗下,倒入装有250ｍｌ无菌生理盐水和玻璃珠的锥形瓶中,充分震荡,使孢子分散 然后稀释至孢子浓度为10 4个／ｍｌ 取4ｍｌ孢子悬液接种到250ｍｌ的锥形瓶中,内装有100ｍｌ即将优选的液体培养基,在291 摇床转速为120ｒ／ｍｉｎ的条件下培养3ｄ。
1.2.6 多因素综合试验[6]
在单因素试验碳源、氮源、ｐＨ值等的条件下，固定ＭｇＳＯ47Ｈ2Ｏ（0.05％）、 ＫＣｌ（0.05％）、ＦｅＳＯ4（0.001％）的基础上 比较豆粕粉 ＋ Ｎ Ｈ4ＮＯ3 、单宁 、小麦粉 、Ｋ2ＨＰＯ4和不同的 ｐＨ 值五个因子， 各取三个水平，并考察豆粕粉 ＋ Ｎ Ｈ4Ｎ Ｏ3组合分别与单宁、小麦粉、Ｋ2ＨＰＯ4的交互作用，由于五个三水平因子和三组交互作用需考察，选用Ｌ27(3 13) 正交表安排该试验[71，72] 以分步优选的培养基的酶活为100％ 因子,水平安排见表 1,表头设计见表2.
1.2.7 Ａｓｐ.ｎｉｇｅｒ Ｎｏ.3的生长与产酶的关系
在最适条件下 每隔24ｈ测定菌丝湿重、菌丝酶、活性 、菌丝可溶性蛋白质的含量。
2 结果与分析
2.1 液体发酵培养基碳 氮源组成对产酶的影响
2.1.1 碳源种类与比例对产酶的影响
分别选用蔗糖 小麦粉 玉米粉为有机碳源 其浓度均为0.5％，再分别添加单宁 1.0％作为诱导剂，以仅添加单宁 1.5％为唯一碳源的培养基作对照，其余成分为 ＮＨ4ＮＯ3 0.15％、ＭｇＳＯ47Ｈ2Ｏ0.05％、Ｋ2ＨＰＯ4 0.1％ 、ＫＣｌ0.05％、ＦｅＳＯ4 0.001％、ｐＨ6.0 经过碳源选择后，再用较优碳源进行比例选择试验，从表 3可看出，在碳源种类试验中，单宁与小麦粉组合时酶活性、酶比活以及每克菌丝的酶产率比较高，因此以单宁与小麦粉为碳源的组合为优选碳源。
从表4可以看出，在单宁与小麦粉比例试验中，其最佳组合是单宁 1.2％、小麦 0.3％、其酶活性、酶比活、每克菌丝的酶产率均最高，说明该碳源浓度组合最好。
2.1.2 氮源种类与比例对菌种产酶的影响
分别选用豆粕粉 2.0％ 酵母浸出汁 2.0％ 豆粕粉 ＋ 硝酸铵 1.34％＋0.05％ 酵母浸出汁 ＋硝酸铵 1.34％＋0.05％ 等有机氮源 有机氮源和无机氮源组合，以只加硝酸铵（0.15％）为唯一氮源的培养基作为对照 ， 其余成分相同 单宁 1.2％ 小麦粉0.3％ ＭｇＳＯ4 7Ｈ2Ｏ 0.05％ Ｋ2ＨＰＯ4 0.1％ ＫＣｌ 0.05％ ＦｅＳＯ4 0.001％ ｐＨ6.0 经过氮源优选后再用较优氮源进行浓度选择试验，从表5可以看出 其 中以豆粕＋ ＮＨ4ＮＯ3氮源次之 而单纯以豆粕粉或酵母、浸出汁为氮源的组合产酶较低，可见有机氮和少量无机氮的结合更利于产酶[1] 因此选用豆粕＋ＮＨ4ＮＯ3的 氮源组合作氮源比例优选试验 从表6可以看出 豆 粕＋ ＮＨ4ＮＯ3的给合的酶活性 酶比活及每克菌丝的酶产率均最高，故该比例组合为较优组合，这可能是豆粕 酵母浸出汁浓度较大时，培养基中非单宁碳源浓度增大，菌种优先利用非单宁碳源 主要促进菌丝生长，导致菌丝生物量和蛋白质含量显著增加而不利于单宁酶的诱导，尽管这些有机氮源中含有某些天然成分能促进菌种产酶，但是高浓度的非单宁碳源存在菌种不优先利用或不利用这些天然成分 从而导致这些天然成分不能对产酶起促进作用，这一点在碳源比例试验中表现突出。
2.2 起始ｐＨ值对菌种产酶的影响
在培养基成分完全一致的条件下 用 0.1ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ或0.1ｍｏｌ／Ｌ ＨＣｌ调节培养基ｐＨ值，分设ｐＨ5.0 9.0 间隔为1的5个不同起始ｐＨ值，然后测定其对产酶的影响，从表7可以看出，该菌株产酶适宜ｐＨ值在6.0-7.0之间，起始ｐＨ值6.0对产酶最为有利，当ｐＨ值＞7.0时 对菌丝生长和产酶均不利。
2.3 多因素正交优选试验结果
根据1.2.6方法进行最佳培养条件的多因素综合试验 其结果见表8 再根据表8的数据进行方差分析，结果见表 9、10、11 可以看出，豆粕粉 ＋ ＮＨ4ＮＯ3单宁小麦粉水平对产酶有极显著的影响 Ｋ2ＨＰＯ4对产 酶无显著的影响 ｐＨ值对产酶也无显著影响 但ｐＨ6.0对产酶最为有利 豆粕粉＋ ＮＨ4ＮＯ3和单宁交互作用显著且以豆粕粉 0.67％ ＋ ＮＨ4ＮＯ30.05％ 和单宁1.2％ 较好 豆粕粉 ＋ ＮＨ4ＮＯ3和单宁交互作用显著且以豆粕粉 0.67％ ＋ ＮＨ4ＮＯ3 0.05％ 和 Ｋ2ＨＰＯ40.03％ 较好 故较优组合为 Ａ1 Ｂ3 Ｃ3 Ｄ1 Ｅ1 确定Ａｓｐ.ｎｉｇｅｒ Ｎｏ.3 的最佳发酵条件为豆粕粉 0.67％ ＮＨ4ＮＯ3 0.05％ 单宁 1.2％ 小麦粉 0.3％ Ｋ2ＨＰＯ4 0.1％ ＫＣｌ 0.05％ ＭｇＳＯ4 7Ｈ2Ｏ 0.05％ ＦｅＳＯ40.001％ ｐＨ6.0
2.4 菌丝的生长与产酶的关系
从图1可以看出、菌丝湿重、菌丝酶活及蛋白质含量均在72ｈ达到高峰，生长与产酶基本同步，因而Ａｓｐ.ｎｉｇｅｒ Ｎｏ.3菌种产酶特征属生长偶联型
3 讨论
单宁与非单宁碳源的比例对产酶有重大影响,控制发酵液中适当的非单宁碳源与单宁比例 ,才能既保证菌株能适度生长,又能提高产酶水平,发酵液中的氮源对产酶也有较显著的影响,有机氮与无机氮的结合使用,能明显提高菌株的产酶水平,这是由于较大浓度的可迅速利用的无机氮源对菌种的产酶有抑制作用,当有机氮源与无机氮源同时使用时,浓度不高的无机氮源供菌丝前期生长,有机氮源以一定的速度转变为可迅速利用的氮源,从而保持发酵液中可迅速利用氮源有一定的量且浓度不太高,避免可迅速利用的氮源对菌种产酶的抑制作用,以提高酶产量,因而在考虑氮源时要注意可迅速利用氮源与有机氮源的结合单宁酶为一糖蛋白,而且糖基含量较高,在菌株合成糖基必需部分碳源合成糖基,而碳源中某些成分则可能是限制糖基合成的因子,若能找出这些限制因子并适当增加这些成分,则可能进一步提高酶产量.正交实验中发酵液ｐＨ值范围对产酶虽无显著影响,但当发酵液ｐＨ＞7时,则单宁可发生分解,使其对酶的诱导作用降低[3] .高起始ｐＨ值培养基经高压灭菌后,培养基中出现大量沉淀,低起始ｐＨ值培养基中出现的沉淀要少,这说明高ｐＨ不但引起单宁分解,还影响单宁结合其它金属离子,进而与蛋白质结合而发生沉淀[3，7]. 把单宁与其它成分分别灭菌,然后混合,则可减少单宁的分解，利于诱导菌株产酶。
