0.前言
纤维素酶是一个多组份的复杂酶体系，且纤维酶对纤维素纤维的作用是个多相催化的反应，与酶的均相反应相比，反应过程要复杂得许多，使对纤维素酶与纤维素的作用机理研究带来非常大的难度［１～３］。目前，随着纤维素酶在纺织品后整理中的应用愈来愈广泛，为了对纤素酶处理织物的过程进行控制，纤维素酶作用纤维的机理研究也日益引起人们的重视［４，５］。
在纤维素酶对纤维素纤维的吸附研究中可知［６，７］，纤维的酶解速率决定于酶与纤维形成的络合物浓度，而不同的纤维由于微结构和分子形态的差异，表现出各自的吸附参数值有很大的差异。本文在吸附平衡研究的基础上，建立了纤维素酶处理织物过程中纤维素酶对纤维水解反应的动力学解示方程，并求得棉、粘胶和亚麻纤维的酶解反应动力学参数，以便能够对纤维素酶处理织物的过程进行控制。
1.实验材料和方法
1.1实验材料
试剂：均为市售AR和CP级。酶制剂：SF纤维素酶(自制)［６，７］。纱线：棉纱，28tex；亚麻纱，222tex(4.5m)；粘胶纱，30tex。均已经过煮练等前处理。
1.2纤维素酶的水解和分析方法
1.2.1酶解方法
在300ml带塞锥形瓶中，分别加入一定量稀释的纤维素酶溶液和0.05M柠檬酸钠缓冲液(pH4.8)，至100ml液体。然后将锥形瓶放入恒温水浴槽中，预热至50℃，再准确称取一定量绝对干重的纱线(105℃烘燥4小时)置于瓶中，保持pH4.8、温度50±1℃的条件进行反应。在不同反应时间内，分别取酶解液测定溶液中的还原糖量。
1.2.2酶溶液中可溶性蛋白质含量的测定
以牛血清蛋白为标准，用Lowry法［８］测定。
1.2.3还原糖量的测定［９］
在25ml试管中分别加入2ml酶解液和3ml DNS(3，5二硝基水杨酸)显色液，沸水浴加热5min显色，冷却，在540mm处测吸光度，求出酶解液中还原糖量(以葡萄糖计)。
1.3计算
纱线酶水解过程中，溶液中残留纤维理论浓度可用还原糖间接估算，如下式所示：
［Ｓt］＝［Ｓo］- 0.9［ＲＳ］ (1)
式中：［Ｓt］：酶处理时间t时纤维的理论残留量(g/l)；
［Ｓo］：纤维初始浓度(g/l)；
［ＲＳ］：还原糖浓度(g/l)。
而纤维的酶解量［Ｙ］(g/l)为：
［Ｙ］＝［Ｓo］-［Ｓt］ (2)
2.结果与讨论
2.1纤维的酶解率与酶解时间的关系
表1为棉纤维在初始浓度［Ｓo］=40g/l、pH4.8、温度50℃的条件下，分别用初始酶蛋白浓度Ｐo=0.04493～2.022g/l的SF纤维素酶处理，测得处理过程中棉纤维的酶解率
｛［Ｙ］／［Ｓo］×１００％｝的实验结果。
表1 处理时间和酶用量对棉纤维酶解率的影响。
|
酶的浓度 ［Ｐo］(g/l) |
酶 解 率 ｛［Ｙ］／［Ｓo］×１００｝ (％)处 理 时 间 (t) (min) | |||||||
|
0 |
15 |
30 |
45 |
60 |
90 |
120 |
180 | |
|
0.04493 |
0 |
0.4550 |
0.9750 |
1.350 |
1.475 |
1.825 |
2.405 |
2.895 |
|
0.1348 |
0 |
0.7250 |
1.155 |
1.425 |
1.625 |
2.575 |
3.055 |
3.605 |
|
0.2246 |
0 |
0.8288 |
1.300 |
1.700 |
2.125 |
2.895 |
3.475 |
4.075 |
|
0.3369 |
0 |
0.9250 |
1.485 |
1.900 |
2.250 |
3.280 |
3.725 |
4.502 |
|
0.4493 |
0 |
1.005 |
1.595 |
2.050 |
2.585 |
3.385 |
4.015 |
4.975 |
|
0.6739 |
0 |
1.100 |
1.675 |
2.300 |
2.850 |
3.675 |
4.425 |
5.405 |
|
0.8985 |
0 |
1.175 |
1.815 |
2.550 |
3.050 |
4.025 |
4.725 |
5.700 |
|
1.348 |
0 |
1.200 |
2.015 |
2.775 |
3.295 |
4.325 |
5.075 |
6.275 |
|
2.022 |
0 |
1.325 |
2.175 |
2.875 |
3.615 |
4.625 |
5.565 |
6.651 |
(SF纤维素酶，棉纤维初始浓度［Ｓo］=40g/L、pH4.8、温度50℃)
|
|
|
图1 纤维残留率与处理时间的半对数曲线 |
由表1可见，随处理时间延长，纤维的酶解率都随之提高，在所有酶浓度条件下，处理初期纤维的酶解速率都相当快，但当处理时间超出120min之后，酶解速率的增加幅度有逐渐降低的趋势；纤维的酶解率随酶的用量的提高而增加，并且在酶用量较低时，酶解率随酶用量提高的幅度要大于酶用量高的情况，因而SF纤维素酶处理棉纤维时，纤维的酶解率与处理时间和酶的用量有关。
若将处理t时间后纤维的残留百分率的对数ln(100［Ｓt］/［Ｓo］)与处理时间(t)作图，结果如图1所示。由图1可见，ln(100［Ｓt］/［Ｓo］)与处理时间(t)存在着良好的线性关系，其相关关系如表2所示。
Van Dyker和Brandt等人［２，１１，１２］曾通过对Avicel和木质等纤维素的动力学研究，提出了纤维素的酶解反应可用一系列平行的准一级反应之和来表述，而根据表1和图1的分析，SF纤维素酶处理棉纤维时，在本实验条件下，纤维的酶解残留量与处理时间应存在着下列关系：
［Ｓt］/［Ｓo］＝e-kt (3)
表2 不同酶浓度时In(100［Ｓt］/［Ｓo］)与处理时间(t)的相关关系
|
酶浓度［Ｐo］（g/l） |
相关直线方程 |
相关系数 |
自由度 |
|
0.04493 |
y=4.60263-0.000189182x |
0.976553 |
6 |
|
0.1348 |
y=4.60275-0.000249601x |
0.9894 |
6 |
|
0.2246 |
y=4.60194-0.000284032x |
0.988494 |
6 |
|
0.3369 |
y=4.60133-0.000307585x |
0.984131 |
6 |
|
0.4493 |
y=4.60072-0.000327305x |
0.982975 |
6 |
|
0.6739 |
y=4.60052-0.000361796x |
0.98456 |
6 |
|
0.8985 |
y=4.60002-0.000389481x |
0.982413 |
6 |
|
1.348 |
y=4.59957-0.000419661x |
0.98122 |
6 |
|
2.022 |
y=4.59935-0.000458802x |
0.984345 |
6 |
注：临界相关系数［10］ R（6）0.01 = 0.8340
式中：t—酶处理时间(min)；［Ｓo］—纤维初始浓度(g/l)；［Ｓt］—酶处理t时间后纤维的残留量(g/l)；［Ｋ］—反应速率常数(min-１)。故将式(3)代入式(2)中，经数学变化后可得：
［Ｙ］／［Ｓo］＝（１-e-k１） (4)
式中(4)中［Ｙ］／［Ｓo］代表着处理时间t时纤维反应初始量的酶解分数(g/g)。式(3)和(4)反映了纤维与酶的反应过程中，纤维的残留量和酶解量与反应时间的关系。若将式(3)经数学变换后，二边再同时取对数，则可得：
ln(100［Ｓt］/［Ｓo］)＝ln100-kt (5)
因而，ln(100［Ｓt］/［Ｓo］)处理时间t应该成线性关系，而由图1和表2可见，在不同酶浓度条件下，ln(100［Ｓt］/［Ｓo］)与处理时间t在0.01水平下均显著线性相关，从而说明了SF纤维酶处理棉纤维时的酶解动力学方程式(式(3)和(4))是完全合理的。
由式(5)可见，利用ln(100［Ｓt］/［Ｓo］)与处理时间t的直线方程的斜率，就可求得酶解反应速率常数k(如表3所示)。由表3可见，酶解反应速率常数k值与SF纤维素酶处理棉纤维时的酶浓度有关，即当酶浓度［Ｐo］提高时，反应速率常数k也随之提高。但在低浓度的情况下(［Ｐo］＜0.5g/l＝，酶浓度对反应速率的影响相当显著，而随酶浓度的不断提高(［Ｐo］＞0.5g/l)，对反应速率的影响程度逐渐降低。这可能是因为，纤维素酶在催化水解纤维时，酶首先必须和纤维表面结合形成ES络合物，而单位重量纤维的特性表面积(Asp)和可供酶形成络合物的位置数(n)是一定的［6，7］，因而，当酶浓度增加到一定程度后，酶浓度的增加还不会使络合物(ES)的浓度有明显的变化，从而使反应速率的增加不明显。由此可见，在SF纤维素酶处理织物工艺过程中，过高的酶浓度对织物进行处理是不经济的。如当SF纤维素酶浓度［Ｐo］从0.04493g/l提高到2.022g/l，尽管酶用量提高了44倍，而酶解反应速度仅仅提高1.5倍。
值得注意的是，式(3)或(4)酶解动力学方程是在处理时间小于180分钟的条件下提出的，若继续延长处理时间，图1中的ln(100［Ｓt］/［Ｓo］)与处理时间t的直线关系会出现明显的偏离。这可能是与酶处理纤维到一定程度后，纤维的内部结构和性能发生变化有关［２，３，１２］。而在实际应用中，纤维素酶处理纤维素类织物时，处理时间一般都控制在45～90分钟之间，不可能超出本实验的范围，因而式(3)和(4)的酶解动力学方程还是具有实际应用意义的。
2.2酶浓度对酶解反应速率的影响
在表1所示的实验条件下，处理一段时间，SF纤维素酶的浓度［Ｐo］与棉纤维的酶解率｛（［Ｙ］／［Ｓo］）×100%｝间的关系，如图2所示。由图2可以看出，在任一处理时间内，随着SF纤维素酶的浓度［Ｐo］提高，棉纤维的酶解率都随之提高，但当酶浓度增加到一定程度后，酶浓度的增加对酶解率的增加逐渐变得不明显。根据酶解反应模型［６，７］可知，纤维的酶解速率或产物的生成速率决定于酶与纤维形成的络合物(ES)的浓度，因而可得下式：
-d［Ｓt］/dt=d［Ｙ］／dt=k２［ＥＳ］ (6)
式中的［ＥＳ］为酶～纤维络合物浓度(g/l)：k２为反应速率常数(min-１)。由式(6)可见，纤维素酶水解纤维的酶解速率与［ＥＳ］成正比，而在SF纤维素酶对纤维底物的吸附研究中得到［６，７］，当酶对纤维进行吸附时，形成的络合物(ES)的浓度与溶液中酶的浓度［Ｅ］存在着如下所示的双曲线关系，即：
［ＥＳ］＝［ＥＳmax］［Ｅ］／（Ｋ２＋［Ｅ］） （7）
式中：［ＥＳmax］为吸附平衡时，纤维吸附后形成的最大络合物浓度(g/l)；［Ｅ］为吸附平衡时液相中游离的酶浓度(g/l)；Ｋ２是纤维素酶的半饱和吸附常数(g酶/l)。
因而，根据酶解速率与［ＥＳ］成正比的关系，假设当酶解处理到t时刻时，纤维的酶解量［Ｙ］与酶的初浓度［Ｐo］间存在着如下的双曲线关系：
［Y］／［So］＝［Y??max］／［So］·［Ｐo］／｛K′+［Ｐo］｝ (8)
式中：［Ｐo ］—纤维素酶初始时的蛋白质浓度(g/l)；［Ymax］—在纤维素酶浓度［Ｐo ］趋于无限大的条件下，酶处理到t时刻时，纤维的最大酶解量(g/l)；K′—酶的半最大酶解常数，为纤维酶解量达到最大酶解量一半［Ｙmax］／２［Ｓ0］需酶的浓度(g/l)。若将式(8)二边同时取倒数，并经适当数学变形，则式(8)可以表示成下列双倒数形式：
(［Ｙ］／［Ｓo］)-１＝Ｋ′［Ｓo］／［Ｙmax］·［Ｐo］-１＋［Ｓo］／［Ｙmax］ (9)
由式(9)看出，经相同时间处理后，(［Ｙ］／［Ｓo］)-１与［Ｐo］-１应成线性关系，其斜率为Ｋ′［Ｓo］／［Ｙmax］，截距为［Ｓo］／［Ｙmax］。
|
|
|
图2棉纤维的酶解率与酶浓度的关系 |
(处理条件：棉纤维［Ｓo］＝40g/l,pH4.8，温度50℃)
表3 棉纤维酶解反应速率常数K值。
|
酶浓度［Ｐo］(g/l) |
酶解反应速率常数K(min-１) |
|
0.04493 |
1.892×10?４ |
|
0.1348 |
2.496×10-４ |
|
0.2246 |
2.840×10-４ |
|
0.3369 |
3.076×10-４ |
|
0.4493 |
3.273×10-４ |
|
0.6739 |
3.618×10-４ |
|
0.8985 |
3.895×10-４ |
|
1.348 |
4.197×10-４ |
|
2.022 |
4.588×10-４ |
(处理条件：棉纤维初始浓度［So］＝40g/l，pH4.8，温度50℃)
图3为在不同处理时间后，SF纤维酶酶解棉纤维的(［Ｙ］／［Ｓo］×100%)-１与［Ｐo］-１的关系曲线，表4为它们的相关关系。从图3和表4可以看出，SF纤维素酶处理棉纤维时，在15-180分钟时间内，(［Y］／［So］×100) -１与［Po］-１存在良好的线性相关关系，故而说明式(8)的关系在本实验条件下是完全合理的。并且由图3和表4可以得到SF酶处理棉纤维时的最大酶解率?(［Ｙmax］／［So］-１×100)和常数K′，如表5所示。
表5表明，SF纤维素酶处理棉纤维时，其最大酶解量｛［Ｙmax］／［Ｓo］｝显著地与处理时间有关，即处理时间越长，(［Ｙmax］／［Ｓo］)值越高。显然地，纤维的最大酶解量与处理时间的关系，也应符合式(4)所示，即：
［Ｙmax］／［So］＝１-ek′t (10)
式中，k′为酶浓度无限大时，纤维的酶解反应速率常数(min-１)。因而，利用表5所示的实验结果，采用非线性最小二乘法，可求得?k′=5.125×10?4min-１，其相关系数R=0.982575。
最大酶解量［Ｙmax］表征着纤维素酶处理纤维时，在特定时间内，纤维理论上能被酶水解的极限程度。若在相同的处理条件下，利用［Ｙ??max］值，能够判断不同纤维素酶对纤维素纤维的酶解能力(或固有活性)的大小，也能判断不同纤维素纤维能被酶水解的难易程度。因而，可以认为最大酶解量［Ｙ??max］是一个比较不同，纤维素酶水解纤维素纤维特性的重要参数，［Ｙ??max］值在一定程度上反映了酶与纤维间酶解反应的内在规律和性能。另外，从表5也可看出，酶的半最大酶解常数K′是一个独立参数，在确定的酶与纤维反应时，K′值的大小与处理时间无关；这是因为在一定条件下，纤维的特性表面积(Asp)和吸附酶的位置数(n)是独立参数，其最大吸附酶量(m)是个恒定值［６，７］，从而使K′值一般仅与纤维素酶和纤维的种类有关。在本实验条件下，SF纤维素酶处理棉纤维时，酶的半最大酶解常数的平均值K′=0.123g/l。
表4 不同处理时间后(［Ｙ］／［Ｓ0］×１００) -１与［Ｐo］-１的相关关系。。
|
处理时间(min) |
相关直线方程 |
相关系数 |
自由度 |
|
15 |
y=0.714796+0.0885811x |
0.982079 |
7 |
|
30 |
y=0.439309+0.0567734x |
0.970035 |
7 |
|
45 |
y=0.34577+0.0427474x |
0.98191 |
7 |
|
60 |
y=0.274731+0.0358224x |
0.98976 |
7 |
|
90 |
y=0.21486+0.0242139x |
0.968856 |
7 |
|
120 |
y=0.17358+0.0204009x |
0.962442 |
7 |
|
180 |
y=0.147536+0.0182376x |
0.972657 |
7 |
注：临界相关系数［10］R(7)0.01＝0.7980。
表5 棉纤维酶解反应的最大酶解率和常数K′。
|
处理时间(t)(min) |
最大的酶解率(%)｛(［Ymax］／［So］)×100｝ |
常数K′(g/l) |
|
15 |
1.3990 |
0.12392 |
|
30 |
2.2763 |
0.12923 |
|
45 |
2.8921 |
0.12363 |
|
60 |
3.6399 |
0.13039 |
|
90 |
4.6542 |
0.11270 |
|
120 |
5.7609 |
0.11753 |
|
180 |
6.7780 |
0.12361 |
|
平均值 |
0.12300 |
处理条件：棉纤维［So］＝40g/l,pH4.8，温度50℃
|
|
|
图3(［Ｙ］／［Ｓo］×100)-1与［Po］-1的关系曲线 |
(处理条件：棉纤维［So］＝40g/l，pH4.8，温度50℃)
结合式(8)和式(10)二个基本方程式，可得到纤维素酶处理纤维时，酶解量［Ｙ］与变量—处理时间(t)和酶浓度［Ｐ0］间对应关系的基本动力学解示方程，如下式所示：
［Ｙ］／［Ｓ0］＝［Ｐ0］／（Ｋ′＋［Ｐ0］）·（１-ek′t） (11)
当SF纤维素酶处理棉纤维时，将上求得的K′和k′值代入式(11)中，可得其酶解反应动力学解示方程为：
［Ｙ］／［Ｓ0］＝［Ｐ0］／（0.123＋［Ｐ0］）·（１-e-5.123×10-4t） (12)
因而，利用式(12)，就可计算棉纤维在一定SF纤维素酶浓度［Ｐo］下，经不同时间处理后的酶解率，并能有效地预测和控制纤维与酶反应的进程。
2.3 SF纤维素酶对不同纤维酶解反应的比较
用浓度［Ｐo］为0.04493～2.022g/l的SF纤维素酶溶液，在pH4.8、温度50℃，纤维初始浓度［So］＝４０g/l的条件下，分别对棉、粘胶和亚麻纤维处理45min和90min，测得的棉、粘胶和亚麻纤维的(［Ｙ］／［Ｓo］×100%)-１和［Ｐo］-１关系曲线，如图4所示。它们的相关关系如表6所示
表6 不同纤维的(［Ｙmax］／［Ｓo］×１００) -１和［Ｐo］-１的相关关系
|
处理时间 |
纤维 |
相关直线方程 |
相关系数 |
自由度 |
|
45min |
棉 |
y=0.345773+0.0427474x |
0.98191JY |
7 |
|
粘胶 |
y=0.32039+0.0398857x |
0.981157JY |
7 | |
|
亚麻 |
y=0.370654+0.0898155x |
0.988872JY |
7 | |
|
90min |
棉 |
y=0.21486+0.0242139x |
0.968856JY |
7 |
|
粘胶 |
y=0.193031+0.0212044x |
0.972619JY |
7 | |
|
亚麻 |
y=0.234987+0.0397643x |
0.981004JY |
7 |
注：临界相关系数［１０］R(7)0.01＝0.7980
表7 各种纤维上的最大酶解率和常数K′。
|
纤维 |
处理时间(min) |
最大酶解率(%)(［Ｙｍａｘ／［Ｓ０］×100)-1 |
常数K，( ｇ／l) |
|
棉 |
45 |
2.8921 |
0.12363 |
|
90 |
4.6542 |
0.11270 | |
|
粘胶 |
45 |
3.1212 |
0.12449 |
|
90 |
5.1805 |
0.10983 | |
|
亚麻 |
45 |
2.6979 |
0.24232 |
|
90 |
4.2556 |
0.16922 |
处理条件：［S０］＝40g/L,pH4.8,温度50 ℃
图4和表6表明，SF纤维素酶处理棉、粘胶和亚麻纤维时，这三种纤维的(［Ｙ］／［Ｓo］×100%)-１和［Ｐo］-１间都存在着显著的线性相关关系，故而，这进一步表明式(8)不仅符合棉纤维的酶解反应，同样也适用于粘胶和亚麻纤维与酶的反应。
由图4和表6求得的SF纤维素酶处理棉、粘胶和亚麻纤维的最大酶解率(［Ｙmax］／［Ｓo］×１００) -１和半最大酶解常数K′，如表7所示。
从表7可以看出，SF纤维素酶处理棉、粘胶和亚麻纤维时，其最大酶解率差异较大。在相同的实验条件下，酶解的极限程度为粘胶＞棉＞亚麻纤维，这表明了粘胶纤维易被SF纤维酶水解，而亚麻纤维则相对较难。但是，从半最大酶解常数K′可见，要达到相同的酶解率，亚麻纤维所需的酶用量最高，而棉和粘胶纤维的酶用量则基本相似。理论最大酶解量［Ｙnax］值的大小，应与纤维最大程度吸附酶的量有关。从SF纤维素酶对棉、粘胶和亚麻纤维的吸附研究知道，纤维最大吸附酶量(m值)，棉为0.1095g/g，粘纤维是0.2237g/g，而亚麻仅为0.06697g/g［６，７］，其实验结果恰好与三种纤维的最大酶解率相吻合，故而，这从另一个方面也证明了本文建立的酶对纤维的吸附等温方程和酶解动力学方程是合理的。
3.结论
1.根据纤维的酶解速率与纤维吸附结合的酶量成正比的关系和实践结果的分析，提出了纤维的酶解率与处理时间和酶的初始浓度的经验关系式，得到了纤维的酶解量与处理时间和酶的浓度的基本动力学解示方程，求得酶解反应参数k、k′、K′和Y??max值，并能有效地预测和控制纤维与酶反应的过程。
2.特性参数［Ｙ??max］和K′值，能够有效地反映酶与纤维间酶解反应的性能。棉、粘胶和亚麻纤维经SF纤维素酶处理后的结果比较表明，在相同的实验条件下，酶解的极限程度为粘胶＞棉＞亚麻纤维而K′值则表明了要达到相同的酶解率，亚麻纤维所需的酶用量最高，棉和粘胶纤维的酶用量则相对较低，其结果正好与酶与纤维吸附的研究结果相吻合。3.酶对纤维的吸附研究结果表明，纤维的特性表面积和可供与酶结合形成络合物的位置数是一定的，因而，在酶解反应时，当酶的浓度较高时，酶浓度的增加将不会使酶与纤维结合形成络合物的量有显著的变化，表现为酶解率的增加不明显。在酶处理织物工艺选择时，过高的酶浓度无论从酶解的角度还是从生产成本的角度考虑都是不合理的。
